槲皮素對卵巢去勢大鼠骨質疏松的影響

閔珺，程清鳳，章橋，袁真

（南昌大學第二附屬醫院，南昌 330006）

女性在絕經期后，由于體內雌性激素的缺乏，導致免疫系統激活，炎癥因子慢性持續增高，最終造成骨量的丟失，骨小梁微結構破壞。臨床上治療骨質疏松所采用的激素替代療法，由于在宮頸癌及子宮內膜癌等方面的副作用而令人擔憂。因此，尋求一種有效且副作用輕的藥物是目前國際醫療界治療絕經后骨質疏松的重要課題。

大量研究已經證實，杜仲黃酮作為杜仲葉中的有效成分，具有抗骨質疏松的療效[1-2]。槲皮素作為杜仲黃酮類有效成分具有類雌激素作用，能夠通過抑制骨質的吸收促進成骨，從而抗骨質疏松的作用[3]。本實驗擬通過研究槲皮素對卵巢去勢大鼠骨質疏松的影響，為臨床治療絕經后骨質疏松癥提供有效的依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物來源8周齡SPF級雌性SD大鼠30只，體重（265.70±7.89）g，購自湖南斯萊克景達試驗動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2016-2002。實驗期間保持良好的通風，室溫在22～26℃，保持40%～60%的相對濕度。

1.1.2 實驗藥品及配制 實驗藥品：槲皮素、羧甲基纖維素鈉（CMC－Na）由Sigma公司提供，產品批號：XSD201510008。槲皮素由sigma公司提供，0.5%羧甲基纖維素鈉溶劑助溶，4℃冰箱避光保存。

1.1.3 主要儀器 （1）離心機：賽默飛世爾科技公司。（2）Mirco-CT檢測儀：（上海懷宇生物有限公司）對大鼠股骨進行掃描并行數據分析。（3）全自動生化分析儀：Roche Diagno’stics。（4）骨密度測量儀：GE公司。

1.2 實驗方法 （1）取8周SD大鼠30只，體重（265.70±7.89）g。適應性喂養1 w后，隨機分成3組，假手術組（Sham組），模型組（OVX組），槲皮素組（Quercetin+OVX組），各10只。（2）OVX組和Quercetin+OVX組：1%的戊巴比妥鈉對SD大鼠進行腹腔注射麻醉后，超凈臺內從大鼠下腹部做縱行切口，切開腹直肌，結扎雙側輸卵管，并切除雙側卵巢，隨后縫合肌層及皮膚；Sham組：切除卵巢附近與卵巢質量大致相等的脂肪組織，不對卵巢做任何處理。術后自由飲水，攝食。（3）術后第3天開始，Sham組、OVX組均每天給予3 mL羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)灌胃，Quercetin+OVX組給予槲皮素溶劑按照50 mg／（kg·d）灌胃。槲皮素給藥劑量根據人鼠等效劑量轉換表進行換算[4-5]。（4）連續灌胃8周后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，經膀胱收集大鼠尿液，檢測尿液中鈣離子（U－Ca）和磷離子（U-P）的濃度水平；同時收集SD大鼠股動脈血液進行離心（3000 r／min），選取上層血清進行鈣離子（S-Ca）及磷離子（S-P）濃度測定。（5）通過剪破心臟處死大鼠，分離SD大鼠一側股骨，置于Mirco-CT線圈進行CT螺旋掃描，計算機測定骨礦物質含量（Bone Mineral Density，BMD）、骨小梁數量（Trabecula,Tb.N）、骨小梁厚度(Trabecula Thickness,Tb.Th)、相對骨體積（Bone Volume,BV/TV）、結構模型指數（Structure Model Index,SMI），取大鼠另外一側股骨，進行骨力學性能分析，測定彈性載荷、彈性橈度、最大載荷和最大橈度。

2 結果

2.1 槲皮素對卵巢去勢大鼠體重的影響 與Sham組比較，OVX組和Quercetin+OVX組的大鼠體重逐漸升高。8周后，兩組大鼠體重與Sham組開始出現差異（P＜0.01），并且OVX組和Quercetin+OVX組兩組大鼠之間體重增長差異不明顯（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠體重測定結果

2.2 槲皮素在血清和尿液中鈣、磷的影響 各組間S-Ca和S-P平均濃度無明顯差異（P＞0.05）。與Sham組相比，OVX組大鼠U-Ca、U-P濃度水平顯著升高（P＜0.05）；Quercetin+OVX組的U-Ca、U-P濃度水平顯著低于OVX組(P＜0.05)；而三組間血鈣與血磷水平無統計學差異（P＞0.05）。以上結果表明，槲皮素能在不同程度上抑制去卵巢大鼠UCa、U-P的丟失。見圖2。

圖2 各組大鼠血鈣、血磷、尿鈣、尿磷測定結果

2.3 槲皮素增加卵巢去勢大鼠股骨干骺端骨小梁數量和骨小梁厚度 從Micro-CT三維重建圖可以看出，與Sham組比較，OVX組大鼠股骨干骺端骨小梁數量顯著減少，骨小梁厚度變??；經槲皮素干預后的大鼠股骨干骺端的骨小梁和厚度均增加，見圖3。

圖3 各組大鼠mirco-CT結果測定

2.4 槲皮素增加卵巢去勢大鼠的BMD值和結構生物力學性能 大鼠在去除卵巢后，由于缺乏雌激素，導致骨量減少，表現為OVX組大鼠的BMD值顯著低于Sham組大鼠（P＜0.01）；在給去卵巢大鼠口服槲皮素后，骨丟失減少，表現為Quercetin+OVX組 大鼠 的BMD值 高 于OVX組 大 鼠（P＜0.05）（見圖4A），且與Sham組相比也存在一定的差異（P＜0.05），結果表明槲皮素可以提高BMD值，但不能逆轉骨丟失。彈性橈度、最大橈度、彈性載荷作為生物力學相關指標，能夠反應骨的力學性能。與Sham組相比，OVX組股骨彈性橈度、最大橈度、彈性載荷及最大載荷均顯著降低（P＜0.05）。經槲皮素干預后，Quercetin+OVX組以上各項指標均高于OVX組（P＜0.05），見圖4B和C。

圖4 B和C示 通過三點彎曲試驗，觀察各組大鼠股骨彈性橈度、最大橈度、彈性載荷及最大載荷值

2.5 槲皮素改善骨形態學參數 通過Micro-CT進行三維立體掃描，結果顯示：與Sham組相比，OVX組 的Tb.N、Tb.Th、BV/TV均 顯 著 降 低(P＜0.05)。OVX組的SMI值高于Sham組大鼠(P＜0.05)；與OVX組相比，槲皮素能顯著提高Tb.N、Tb.Th、BV/TV，改善股骨微結構(P＜0.05)，見圖5。

圖5 各組大鼠骨相關參數測定

3 討論

骨質疏松的治療一直以來都是一個難題，臨床上常使用雌激素補充療法來治療絕經后骨質疏松，但雌激素的副作用，在一定程度上限制了它的用途。有證實杜仲黃酮能夠影響骨代謝，并發揮著積極的作用。槲皮素是杜仲黃酮亞類的主要單體成分，已有的研究發現其具有抗骨質疏松的作用，但其機制不明。研究者Kim YJ采用RT-PCR和實時熒光定量PCR分析表明槲皮素能夠誘導骨橋蛋白、骨形態發生蛋白和Runx2的表達增加，小鼠體內實驗證實了槲皮素能夠通過激活雌激素受體依賴機制增強細胞成骨分化，從而增加骨密度，改善骨微結構[6-8]。

本研究選取8周齡的SD大鼠，去勢后結果顯示假手術組（Sham組）的骨小梁厚度、骨小梁數量等指標均顯著高于OVX組，表明造模成功。骨的構成主要是分為骨礦物質與骨基質兩部分。在骨微環境中，存在著破骨與成骨的一個動態平衡，絕經后的大鼠，這個平衡系統被打破，破骨占據優勢時，骨的吸收增加[9]。通過檢測血液和尿液中的鈣離子、磷離子水平，可以間接反映骨的代謝情況。研究顯示，卵巢去勢大鼠與正常健康大鼠相比，血清鈣、磷離子濃度水平之間無明顯差異性，尿液中鈣離子與磷離子的濃度顯著升高，說明尿鈣與尿磷的排泄，可能與骨密度的下降有一定相關性[10]。而本研究也發現，OVX組大鼠尿鈣和磷的水平明顯較Sham組升高，槲皮素能夠顯著降低OVX大鼠尿鈣和磷的水平，其結果與以往研究一致。

我們通過觀察槲皮素治療卵巢去勢大鼠骨質疏松的療效，發現槲皮素能夠在不影響大鼠體重的前提下增加去卵巢大鼠的骨小梁數量（Tb.N）及骨小梁厚度(Tb.Th)，增加骨礦物質含量(BMD)，即槲皮素能夠改善骨的微結構，提高骨的質量，我們的研究結果與以往的研究一致[11]。實驗使用Micro-CT對大鼠股骨的干骺端進行掃描，對股骨結構的骨形態學參數進行分析。BV/TV、TB.N、Tb.Th作為骨結構的正向指標，實驗結果提示去除卵巢的大鼠，將會導致骨小梁結構生長不良，BV/TV、TB.N、Tb.Th均下降，骨小梁出現斷裂甚至消失。而SMI是骨形態參數的一個負性指標，理想狀態下，標準桿狀骨和板狀骨的SMI值分別為3和0。去除卵巢的大鼠較正常大鼠的SMI值高。實驗證實槲皮素可降低SMI值，改善骨的微結構環境，減少骨質丟失，盡管如此，但卻不能逆轉骨的丟失。這也提示我們，盡早開展絕經后的骨質疏松治療可以有效的降低骨丟失，女性絕經期間骨質疏松的預防尤為重要。

此外本實驗通過測定骨力學性能分析，其結果顯示槲皮素能夠提高骨的載荷和橈度，說明槲皮素能夠改善骨的功能。因此槲皮素能夠從結構和功能兩方面治療絕經后骨質疏松。

有研究表明增加血鈣的吸收，減少尿鈣的排泄，對防止骨密度的降低能夠起到一定的幫助作用[12]，這與研究結果中槲皮素干預組OVX大鼠尿鈣、尿磷減低的結果一致。以上實驗數據表明槲皮素能夠增加骨礦物質含量，減少鈣磷丟失，來保持骨的形成與吸收平衡不被打破。

已有綜述報道，槲皮素具有類雌激素作用，能夠通過抑制骨質的吸收達到促進成骨的作用[13]。有研究表明[14]，在刺激骨祖細胞向成熟的成骨細胞分化過程中，雌激素扮演著重要角色。去除卵巢后的大鼠由于雌激素的缺乏能顯著增加大鼠體重，而本研究結果顯示Quercetin+OVX組與OVX組大鼠體重無明顯差異，表明槲皮素不能抑制雌激素缺乏所致的大鼠體重增加，但另一方面也證實該藥物在體重方面無不良影響。目前應用雌激素治療絕經后骨質疏松在宮頸癌及子宮內膜癌等方面的副作用令人擔憂，上述研究結果使我們減輕了該成分在子宮相關并發癥方面的顧慮[15-16]，為今后運用槲皮素等杜仲黃酮類治療絕經后骨質疏松以及其他疾病提供理論疾病。

綜上所述，槲皮素作為杜仲黃酮類單體對去卵巢大鼠具有抗骨質疏松的作用。槲皮素是通過改善骨代謝，增加BMD，提高骨形態學參數達到抗骨質疏松的作用。在此部分研究中，我們已成功分離并培養大鼠骨髓間充質干細胞，后續的實驗中我們將從細胞層面研究其具體抗骨質疏松機制。