淫羊藿苷通過雌激素受體抑制破骨細胞分化及骨吸收的研究

甘菊文，謝保平，廖曉飛

（1.贛州市人民醫院；2.贛南醫學院心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，贛州 341000）

骨質疏松癥（osteoporosis,OP）是危害中老年人特別是絕經后婦女健康的常見病之一，其特征在于骨量、強度和微結構的系統性損傷，從而增加了脆性骨折發生的傾向[1]。雌激素作用于破骨細胞雌激素受體（Estrogen Receptor,ER），通過ER直接或者通過FasL旁路機制誘導破骨細胞的凋亡，直接抑制破骨細胞的分化或者骨吸收活性[2]。淫羊藿具有補益腎陽、強筋健骨等功效，常用于骨質酥松、骨折后期。淫羊藿苷（Icaritin,ICT）是淫羊藿最重要的單體有效成分[3]。目前研究指出ICT可以抑制破骨細胞（Osteoclast,OC）分化而發揮抗OP的作用[4-5]，但對其抑制破骨細胞分化機理的研究，特別是從雌激素受體水平角度探討ICT抑制破骨細胞分化的研究報道很少。

1 材料與方法

1.1 材料ICT（中國科學院成都生物研究所）；RAW264.7（中國科學院細胞庫）；胎牛血清（Gibco美國），高營養的營養劑（Gibco美國），TRAP染色試 劑 盒 （SIGMA美 國），小 鼠 重 組RANKL（Peprotech美國），甲苯胺藍zguo染色液（Solarbio美國），氟維司群（ICI182780，美侖生物 中國），4%多聚甲醛（北京鼎國昌盛生物科技有限公司），17-β-雌 二 醇 （E2，SIGMA美 國），MPP（Cayman Chemical美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 為了檢測ICT是否通過ER抑制破骨細胞的分化，用ICI182780競爭性阻斷ER的功能，用TRAP染色方法檢測競爭性阻斷ER后ICT對破骨細胞分化的影響。分為：Control組、RANKL組、RANKL+ICI182780組、E2(1 μM)組、E2(1 μM)+ICI182780組、ICT(10 μM)組、ICT(10 μM)+ICI182780組，每組設置3個復孔。

1.2.2 TRAP染色 將狀態較好的RAW264.7細胞接種于48孔板上，每孔密度為5×103個，12 h后，含ICI182780的 實 驗 組 用 濃 度 為1 μM的ICI182780先處理1 h，然后按實驗分組換有或者沒有ICI180780且含RANKL(50 ng/mL)的培養基培養，每2天換液1次。從第5天開始染色觀察細胞（注意破骨細胞成熟或者長大到一定大小時容易破裂），每2 h一次。在37℃條件下預熱足夠的PBS，用PBS洗滌兩次，4%多聚甲醛固定20 min，用預熱PBS徹底清洗3次。配制TRAP染液：取1.5 mL EP管，加50 μL氨偶氮苯和50 μL亞硝酸鈉混勻30 s，室溫靜置2 min，得GBC液，取15 mL離心管，加水4.5 mL，GBC液100 μL，萘酸AS-BI磷酸鈉液50 μL，醋酸鹽200 μL，避光加入酒石酸鹽100 μL，充分混勻，得TRAP染液。每孔加入上述染液300 μL，37℃水浴鍋中避光孵育1 h，隔30 min觀察一次染色情況，待細胞質呈酒紅色，細胞核清晰可見時，用37℃PBS沖洗干凈(2~3次)，顯微鏡下觀察TRAP染色后的細胞，胞質呈酒紅色，細胞核數目大于3的為成熟破骨細胞，將每孔破骨細胞按“井”字樣分成9個區域，并統計每孔破骨細胞數，用于統計分析。

1.2.3 骨吸收功能評價 （1）骨片前處理 取新鮮牛股骨骨干，手工制備厚度為100~200 μm的骨片，修剪成48孔板大小。雙蒸水超聲清洗3次，每次30 min。浸泡于75%酒精中，4℃保存備用。無菌雙蒸水或者滅菌PBS清洗骨片3次，紫外照射骨片正反面各30 min。完全培養基浸泡過夜，第2天用于種板。（2）誘導及染色 將狀態良好的RAW264.7細胞接種于含有經前處理的骨片的孔板中，使每孔含細胞5×103個。實驗組和對照組均每組設3個復孔，培養12 h后，換含藥物或者ICI182780和RANKL(50 ng/mL)的培養基，方法同1.2.2。前4天每2天換液1次，第5天開始每天換液，并在骨片的周圍可以看到破骨細胞，誘導8天后，用PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，加0.25 mol/L氨水超聲清洗3次，每次15 min，依次用60%、70%、80%、90%和100%乙醇脫水，每次脫水5 min，自然晾干，后加入甲苯胺藍染液染色5 min，顯微鏡下觀察并拍照，用Image-Pro-Plus 6.0軟件計算骨吸收面積。

1.2.4 ICT通過ERα抑制破骨細胞分化和骨吸收功能 為了進一步驗證ICT是通過ERα/β抑制破骨細胞分化和骨吸收功能，用ERα特異性的阻斷劑MPP阻斷ERα，用TRAP染色考察ICT對破骨細胞分化的影響，實驗分組：Control組、RANKL組、E2組、E2+MPP組、OA(5 μM)組、OA(5 μM)+MPP組、OA(10 μM)組、OA(10 μM)+MPP組，實驗方法同1.2.2。用甲苯胺藍染色評價骨吸收功能，實驗分組同上，實驗方法同1.2.3。

2 結果

2.1 ICT通過雌激素受體抑制破骨細胞分化 用TRAP染色檢測ICI182780競爭性阻斷ER后ICT對破骨細胞分化的影響。與RANKL組相比，ICT(10 μM)和E2(1 μM)顯著抑制破骨細胞分化(P＜0.01)；與ICT(10 μM)和E2(1 μM)單獨處理組相比，加入ICI182780處理后，抑制破骨細胞分化的作用減弱；在沒有ICT或者E2存在的情況下，單獨用ICI182780處理不影響破骨細胞的分化(P＞0.05)。以上說明ICT可能是通過ER抑制破骨細胞的分化(圖1)。

圖1 TRAP染色結果與統計結果圖

2.2 ICT通過雌激素受體抑制破骨細胞骨吸收功能 為了判斷ICT是否通過ER抑制破骨細胞骨吸收功能，用ICI182780與ICT共同處理RANKL誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化，用甲苯胺藍染色法評價骨吸收功能。結果如圖2所示，與RANKL組相比，ICT和E2顯著地抑制破骨細胞骨吸收功能(P＜0.01)，ICI182780單獨處理組沒有抑制效應或者上調破骨細胞的骨吸收功能，但沒有統計學意義(P＞0.05)。與ICT或者E2單獨處理組相比，ICT或E2與ICI182780共同處理組的RANKL誘導的破骨細胞骨吸收功能更強(P＜0.05)，提示ICT是通過ER抑制破骨細胞骨吸收功能。

圖2 甲苯胺藍染色法評價骨吸收功能的結果圖

2.3 ICT通過ERα抑制破骨細胞骨吸收功能 為了進一步驗證ICT通過ERα抑制破骨細胞骨吸收功能，用ERα特異性阻斷劑MPP阻斷ERα，用甲苯胺藍染色考察ICT對骨吸收功能的影響。與RANKL組相比，各濃度的ICT顯著抑制破骨細胞骨吸收功能，且MPP單獨處理組上調骨吸收功能，但沒有統計學意義(圖3)。與ICT或者E2單獨處理組相比，加入MPP后，ICT抑制破骨細胞骨吸收功能的作用減弱，差異有統計學意義(圖3)。

圖3 ICT通過ERα抑制破骨細胞骨吸收功能

3 討論

OP癥主要由于骨組織內的破骨細胞（OC）和成骨細胞(OB)的功能活動平衡被破壞所致[6]。機體內所有促進破骨細胞分化或者抑制成骨細胞生成的因素都能導致OP的發生。OC是機體中唯一具有骨吸收作用的細胞，目前調節OC活性被認為是治療OP較為直接且有效的方式。雌激素是甾體類化合物，雌激素分泌不足是導致絕經后婦女患OP癥的重要原因。雌激素可提高1a-羥化酶活性，促進1,25二羥維生素D3產生，可促進降鈣素的分泌和抑制甲狀旁腺素的骨吸收[7]。

雌二醇是天然雌激素，通過ER直接抑制破骨細胞功能。RANKL是誘導破骨細胞形成和成熟的必需因子，RANK是破骨細胞膜上RANKL唯一的信號受體，RANKL與破骨細胞膜上受體RANK結合，激活下游信號分子調控破骨細胞的分化[2]。本研究提示ICT具有雌激素樣作用，可能通過ER/RANK信號通路抑制破骨細胞分化。

本研究用ICI182780拮抗ER功能后，ICT抑制破骨細胞分化和骨吸收功能的效應減弱，但沒有完全抑制，可能的原因有兩個，一是ICI182780是雌激素受體的競爭性阻斷劑，與ICT競爭雌激素受體作用位點，沒有完全阻斷雌激素受體；二是ICT可能有其他途徑抑制破骨細胞分化，如RANKL信號通路。為了進一步研究ICT通過ERα抑制RANKL誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化，本研究用ERα特異性阻斷劑MPP阻斷ERα，用TRAP染色和甲苯胺藍染色評價阻斷ERα后ICT對破骨細胞分化和功能的影響，結果提示ICT可能是通過ERα抑制RANKL誘導的破骨細胞骨吸收功能。

ICT目前主要是作為肝病治療的輔助藥物，本研究旨在闡明ICT的抗OP機制，為ICT抗OP研究提供新的作用靶點，也為開發ICT臨床用于抗OP提供理論支持。