4例CHARGE綜合征新生兒的臨床表現及CHD7基因突變分析

魯藝，李紅，易麗君，段芳芳，蔣文星，胡清華

（江西省兒童醫院中心實驗室，南昌 330006）

CHARGE綜合征（OMIM 214800）是一種常染色體顯性遺傳疾病，發病率大約在1/8500~1/15000[1]。以眼部缺損、心臟疾病、后鼻孔閉鎖、生長發育遲緩、泌尿生殖系統缺陷/性腺功能減退以及耳部畸形/耳聾為主要臨床癥狀[2-3]，腎臟異常、唇/腭裂和氣管食管瘺等也被頻繁報道[4]。CHD7基因是主要的致病基因，CHD7突變大約占總病例的60%[5]，并且在嚴格符合Blake或Verloes診斷標準[5-6]的患者中有90%~95%攜帶CHD7變異體[6]。因此，2016年Hale等人[7]建議將CHD7基因變異加入到主要診斷標準中，致病性CHD7突變加一個主要表現即可診斷CHARGE綜合征。隨著分子檢測技術的進步，越來越多的可疑病例可以及時得到基因檢測[8-9]，通過了解CHARGE綜合征的不同基因型，可以為愈來愈多的CHD7突變體明確基因型與表型的關聯；通過CHD7突變患兒臨床表型的分析，亦可以擴大CHARGE綜合征的臨床表型。目前，國內CHARGE綜合征報道相對較少，本文報道本院2018年至2019年收治的4例攜帶CHD7基因突變的患兒，對他們臨床表現進行總結及CHD7基因突變進行分析，以增加臨床醫生對CHARGE綜合征發展和臨床表現的了解，并及時診斷，從而更及時地進行臨床護理和獲得基因咨詢。

1 對象與方法

1.1 對象 回顧性病例總結。納入2017年1月至2019年12月本院收治的4例（男1例、女3例）存在CHD7基因突變患兒為研究對象。正常組為265名新生兒常見遺傳病基因篩查樣本，患兒父母均簽署知情同意書，研究獲得醫院倫理委員會批準（批準號：JXSETYY-YXKY-20180015）。

1.2 方法 高通量測序及父母Sanger驗證：采集患兒及父母靜脈血樣，提取患兒基因組DNA，使用Tagment DNA enzyme酶 切法(Illumina)將DNA打斷為100~200bp片段。采用IDTxGenExome V2全外顯子試劑盒(IDT)對靶向20000+目標基因的外顯子區域進行富集捕獲。捕獲文庫經過Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument(Agilent)質檢，確認合格后采用Illumina Novaseq6000(Illumina)高通量測序儀測序。下機后測序原始數據以FastQC軟件進行質控分析，后續進一步采用Sentieon(Sentieon)比對軟件將測序序列與人類基因組參考序列(GRch37/hg19)比對并分析單核苷酸變異和插入/缺失，最后將VCF格式的變異文件導入至FLIMS系統(Fulgent Genetics)，對變異位點根據致病性、表型和家系遺傳模式進行篩選。通過ACMG標準對全部變異進行分級。而后提取先證者父母的外周血DNA，對二代測序中檢測出的致病、可能致病與臨床意義不明3類突變位點進行父母Sanger測序驗證。

2 結果

2.1 二代測序結果及父母Sanger驗證結果4例先證者CHD7基因分別存在c.686ldelC(p.Y2288Tf-sTer9)、c.7192C>G(p.R2398G)、c.1366C>T(p.Q456X)和c.5210+3A>G雜合變異（見圖1）。Sanger測序驗證結果顯示4例患兒的父母均未攜帶上述變異，4例先證者變異均為新發突變（見圖2）。c.686ldelC(p.Y2288TfsTer9)變異會導致所編碼的氨基酸提前截短，影響蛋白的正常功能，查閱HGMD數據庫、ExAC數據庫及相關文獻，該變異為未報道的新變異；c.7192C>G[10]、c.1366C>T[4]以及c.5210+3A>G[11]均已被報道過。在265名正常對照中未檢測到以上變異。本文報道的4個突變位點的區域均位于高度保守區（見圖3），故本文報道的變異區域在脊椎動物中可能具有重要作用，該區域的變更可能導致疾病的發生。

圖1 CHD7蛋白結構示意圖[12]CH：chromo結構域；SNF2：ATP酶或解旋酶結構域；Helicase_C：解旋酶結構域；SANT：SANT結構域；BRK：BRK結構域。紅色箭頭為本文4例患兒氨基酸突變位置。

圖2 Sanger驗證測序結果A,C和E分別為患兒1，患兒1父親和患兒1母親的測序圖；B,D和F分別為患兒2，患兒2父親和患兒2母親的測序圖；G,I和K分別為患兒3，患兒3父親和患兒3母親的測序圖；H,J和L分別為患兒4，患兒4父親和患兒4母親的測序圖。箭頭示基因變異位點，4例先證者的父母均未檢測到CHD7基因突變。

圖3 不同種屬間CHD 7蛋白序列保守性分析 蛋白質序列下面的（*）表示保守序列、（:）表示保守變體、（.）表示半保守變體、（）表示非保守序列。紅色箭頭處分別為本文4例患兒突變位點。

2.2 臨床診斷分析及臨床癥狀特點 依據相關文獻及Hale診斷標準，本文聯合臨床癥狀與基因檢測對本院4例存在CHD7基因突變患兒進行診斷，其中3例可診斷為CHARGE綜合征，患兒2雖有檢測到CHD7基因可疑致病變異，但臨床癥狀不明顯，還不足以診斷為CHARGE綜合征。4例患兒臨床癥狀總結見表1。

表1 4例攜帶CHD7基因突變患兒的臨床特征

3 討論

CHD7基因突變聯合典型的臨床表型可明確診斷CHARGE綜合征[7]。CHD7廣泛表達于胚胎和成體多種組織細胞中，不僅影響神經系統和生殖系統的發育，還廣泛影響著眼、耳、心臟和骨骼等多個器官的發育，故CHARGE綜合征患者的表型具有典型的異質性和復雜性[13]，這種臨床表現高度可變和缺乏強制性檢查因素造成該病的診斷困難。最近，一種由全身系統和年齡組成的新檢查表已被開發出來以幫助診斷CHARGE綜合征[14]，該檢查表主要回顧了歐洲國家CHARGE綜合征患者最常見的需要管理的問題，以及在這些患者的整個生命周期中醫生可能忽略的關鍵問題，但目前還沒有針對中國人群CHARGE綜合征檢查的全面指南。故本文報道4例存在CHD7基因突變患兒，總結其臨床癥狀，為以后制定中國人群CHARGE綜合征全面檢查表提供一定幫助。

我們主要依據Hale診斷標準，4例患兒中有3例可以診斷為CHARGE綜合征，其中患兒2現有的臨床癥狀還無法診斷為CHARGE綜合征，因該綜合征表型的顯著差異性，有些癥狀在新生兒期難以察覺，如視力、聽力、性腺發育不良等[15]，而該患兒亦未進行詳細的全身檢查，如眼球及視力檢查、頭顱CT，聽力及半規管檢查等，因此該患兒也無法排除CHARGE綜合征，隨后對患兒2進行的隨訪過程中，應注意對應CHARGE綜合征常見表征進行隨訪。患兒1有明顯的外耳畸形及聽力異常、先天性心臟病、骨骼發育異常及宮外發育遲緩，加上CHD7基因（c.6861delC）致病突變可診斷為CHARGE綜合征，c.6861delC為未報道過的新位點，該變異位點的檢出擴展了CHD7基因的變異譜。據報道，80%～100%的CHARGE綜合征患者存在耳朵異常，大多數外耳異常包括垂耳或杯狀耳、耳廓低或垂直高度降低等[16-17]，半規管發育不全是公認的CHARGE主要表征，可被認為是內耳畸形，在95%的CHARGE綜合征患者中有聽力損失表現，這些需通過CT或MRI檢查來確認[18]。多數醫院，包括我們醫院，不使用CT或MRI作為初始篩查的一部分，除非有其他跡象證明需要[19]，這可能導致一些表征難以發覺。在本研究中，患兒1和患兒4存在外耳畸形和耳位低，僅有患兒1表現先天性耳聾，其他2例患兒聽力測試通過，這一比例低于文獻報道比例，可能與本研究病例數較少有關。先天性心臟缺陷存在于3/4 CHARGE綜合征患者中，其缺陷類型各不相同，從房室間隔缺損到主動脈弓畸形均有被報道[20]。本文報道的3例CHARGE綜合征患兒均有先天性心臟缺陷存在，3例患兒缺陷類型均有房間隔缺損（ASD）和動脈導管未閉（PDA）。此外，在患者1還發生第2足趾突出，前囟極小癥狀；患者3出現腎盂分離及生殖器發育不良；患兒4有消化道出血、新生兒腦病和雙側髖關節發育不良，這些表征為CHARGE綜合征少見的臨床特征[21]。盡管CHARGE綜合征患者的表型不同，但值得注意的是3例CHARGE綜合征新生兒均出現先天性心臟缺陷、肺炎和先天性喉喘鳴，這表明當這些癥狀同時出現時，可被認為是CHARGE綜合征的臨床診斷線索之一。

本文總結4例攜帶CHD7基因雜合突變患者的臨床表型，我們的研究表明，肺炎合并先天性喉喘鳴尤其是當它還伴有典型的結構畸形時可被視為CHARGE綜合征的臨床診斷線索之一，我們充分利用了基因檢測的優勢來診斷新生兒復雜的先天性疾病，這有助于醫生做出針對性的治療決策。本文報道的4例患者均為新生兒，CHARGE綜合征的新生兒期診斷可提前對患兒多個器官系統進行評估與干預，尤其是神經系統和性腺軸中央激活情況，在隨后的青春期進行早期干預、誘導，使其與同齡人同時發生第二性特征發育。基因檢測可增進臨床醫生對CHARGE綜合征發展和臨床表現的了解，并可促進及時診斷，早期的支持和矯正療法，特別是在控制感染，改善呼吸和進食方面，對患者的預后至關重要。由于基因檢測的開展具有對CHARGE患者進行快速診斷和方便進行隨訪的好處，我們建議對不完全符合臨床診斷標準的可疑病例進行基因檢測。