鵪鶉MITF 基因多態性與羽色性狀的關聯性分析

袁兵杰，張奕菲，劉 佩，王 娜，鄭騰飛，祁艷霞,2*

（1.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471003；2.洛陽市動物遺傳育重點實驗室，河南洛陽 471003）

小眼畸形相關轉錄因子（Microphthalmia-Associtated Transcription Factor，MITF)最早由德國科學家Hertwig 于1942 年在突變小鼠后代中發現，并將該突變位點命名為mi，突變個體表現為毛色、虹膜色素退減、小眼畸形和耳聾。在1993 年，最先由Hodgkinso從小鼠中克隆得到對應的mi 位點基因MITF[1]。MITF屬于MITF 轉錄因子家族，該基因編碼區有9 個外顯子，編碼419 個氨基酸，MITF 基因編碼的蛋白具有基本-螺旋-環-螺旋-亮氨酸拉鏈（basic-Helix-Loop-Helix-LeucineZip-per，bHLHZip)結構[2]，該結構橫跨90 個氨基酸，基礎部分由11 個氨基酸組成，是MITF 蛋白的轉錄激活結構功能區，另外在N-末端和C-末端分別具有一個強轉錄激活結構功能區和一個富含絲氨酸的激活域[3]。本實驗的目的是通過PCR-SSCP 方法尋找多態性位點，探索MITF 基因與朝鮮鵪鶉羽色之間的關聯性。

MITF 蛋白是一種核蛋白，參與并調節成黑色素細胞和黑色素細胞的生長發育。試驗證明，MITF 基因突變使得黑色素合成受阻，小鼠毛色表型呈現為白色皮毛[4]。本實驗選取北京白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉，提取DNA 后對目的基因進行擴增并檢測，利用不對稱PCR-SSCP 聚丙烯酰胺凝膠電泳對比分析以確定突變位點，分析各SNP 位點與羽色性狀的關聯性，用以后續總結分析，得到此項內容具有一定的研究價值。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

北京白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉取自河科大鵪鶉種業有限公司。隨機選取300 枚北京白羽鵪鶉和朝鮮鵪鶉（栗羽)受精蛋，于2020 年9 月份進行孵化，在孵化10d 時[5]采其翅組織樣品，迅速投入液氮中保存用于提取DNA。

1.2 朝鮮鵪鶉基因組DNA 提取

DNA 提取采用上海生工生物工程有限公司的試劑盒，進行室溫離心后收集DNA 溶液，可立即進行下一步試驗或置于冰箱-20℃保存。

1.3 朝鮮鵪鶉MITF 基因不對稱PCR-SSCP 分析

PCR 擴增分兩次進行，第一次擴增反應體系：2×Taq Master-Mix 10μL，上下游引物各0.7μL，DNA 模板1μL 和ddH2O 7.6μL，總體積20μL。反應條件：95℃預變性4min；95℃變性30s，退火30s，72℃延伸1min，36 個循環；72℃10min。反應所需的引物分別為MF3S、MF4S、MF5S（表1)。將目的基因PCR 擴增產物于110V 電壓下，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳對其進行檢測，隨后將所得的產物置于冰箱保存備用。第二次PCR 反應體系：第一次PCR 擴增產物1μL，上游引物或下游引物0.7μL，2×Taq Master-Mix10μL，最后加水至20μL。反應條件同第一次PCR，20 個循環。對目的基因PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并置于冰箱保存備用。

表1 朝鮮鵪鶉MITF 基因引物信息

1.4 不對稱PCR-SSCP 聚丙烯酰胺凝膠電泳及分析

取8μL 第二次擴增產物和2μL 6×loading buffer混合均勻，4℃下在12%的聚丙烯酰胺凝膠[V（丙烯酰胺)∶V（亞甲雙丙烯酰胺)=29∶1]上200V 電泳15min 后，調整電壓至100V，電泳10h，（具體電泳時間根據片段大小不同可進行調整)。電泳完畢后，取下玻璃板，進行染色，拍照保存，進行分析。每個基因型個體分別選取3 份PCR 擴增產物，送去測序，對比分析以確定突變位點。

1.5 SNP 位點與羽色性狀的關聯性分析

計算基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量（PIC)，并運用皮爾遜卡方檢驗檢測朝鮮鵪鶉群體是否處于Hardy-Weinberg 平衡。利用SPSS13.0 進行χ2獨立性檢驗，分析各SNP 位點與羽色性狀的關聯性。

2 結果與分析

2.1 PCR 擴增結果

圖1 為北京白羽鵪鶉和栗羽朝鮮鵪鶉MITF 基因外顯子4、外顯子5 和3′UTR 的PCR 擴增結果，其片段長度分別為199、191 和185bp。產物條帶清晰、無雜帶，可以用于后續測序分析。

圖1 鵪鶉MITF 基因PCR 產物的電泳檢測

2.2 MITF 基因不對稱PCR-SSCP 電泳分析

經不對稱PCR-SSCP 分析，MITF 基因擴增片段中均有2 個等位基因：A 和B，有3 種基因型：AA、BB 和AB，如圖2 所示。

圖2 鵪鶉MITF 基因擴增產物不對稱PCR-SSCP 分析

2.3 不對稱PCR-SSCP 測序結果分析

選取AA 型、AB 型和BB 型個體PCR 產物各3份進行測序，結果顯示有3 個突變位點，如圖3 所示，分別為c.589A＞G、c.761A＞G 和位于3′UTR 的c.2275C＞T，其中c.589A＞G 堿基的突變使得賴氨酸變為谷氨酸，如圖4 所示，且在3′UTR C＞T 的突變可能改變MicroRNA 結合，導致基因轉錄活性改變，具有一定的研究價值。

圖3 鵪鶉MITF 基因3 個突變位點的序列比對分析

圖4 MITF 基因c.589A＞G 突變導致編碼蛋白氨基酸的改變

2.4 鵪鶉MITF 基因突變位點的遺傳信息分析

在鵪鶉群體中MITF 基因的3 個SNP 中的優勢等位基因頻率分別為0.68、0.68 和0.65，其中c.589A＞G 和c.761G ＞A 位點的優勢等位基因為A，c.2275C＞T 位點的優勢等位基因為B。對群體多態信息含量分析發現，3 個突變位點均表現為中度多態（0.25＜PIC＜0.5)（見表2)。對3 個多態位點進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，鵪鶉群體在c.589A＞G、c.761A ＞G 和 c.2275C ＞T 3 個位點都達到Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05)（見表3)。

表2 MITF 基因不同基因型的群體遺傳學分析

表3 MITF 基因不同突變位點的Hardy-Weinberg 平衡檢測

2.5 鵪鶉MITF 基因突變位點與羽色的關聯性分析

對朝鮮鵪鶉和北京白羽鵪鶉2 個群體的3 個多態位點進行個體基因分型，計算各個突變位點的基因頻率和等位基因頻率，利用SPSS 13.0 軟件進行顯著性檢驗，并分析兩種羽色群體各突變位點基因型與羽色性狀的關聯，結果見表4。由表4 可知，在c.589A＞G 位點，兩個羽色群體之間基因型分布存在極顯著差異（P＜0.01)。同時，在c.2275C＞T 位點，兩個羽色群體之間基因型分布存在顯著差異（P＜0.05)。由此可以推斷，MITF 基因的c.589A＞G 和c.2275C＞T 突變位點可能與朝鮮鵪鶉羽色性狀具有一定的關聯性。

表4 朝鮮鵪鶉MITF 基因多態性與羽色性狀的關聯性分析

3 討論

動物不同的被毛顏色與羽毛顏色一直是育種工作者關注的主要問題。動物黑色素變異性沉著是肉眼可見的表型性狀[6]，是眾多基因共同作用的結果。黑色素的合成是酪氨酸酶催化體內酪氨酸羥化而啟動的一系列反應過程。酪氨酸酶、酪氨酸相關蛋白1 和多巴色素互變異構酶功能紊亂會導致黑色素沉著失調[7]。本試驗通過設計3 對引物，分別擴增MITF 基因外顯子4、外顯子5 和3′UTR 的DNA 序列片段，利用不對稱PCR-SSCP 技術分析，于外顯子4、外顯子5和3′UTR 的DNA 序列片段均發現三種基因型，即AA、AB 和BB，測序后經DNAMAN 軟件比對發現3 個突變位點，皮爾遜卡方檢驗表明朝鮮白羽鵪鶉群體在c.589A ＞G、c.761G ＞A 和c.2275C ＞T位點均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態（P＞0.05)。在c.589A＞G和c.2275C＞T 位點處栗羽朝鮮鵪鶉的3 種基因型（AA、AB 和BB)的頻率分布與北京白羽鵪鶉的3 種基因型頻率分布存在顯著差異（P＜0.01)，說明該突變位點與鵪鶉羽色之間存在一定的關聯性。這與黃晶[8]研究結果相一致，另有學者研究表明，純合子日本鵪鶉和雜合子日本鵪鶉羽色性狀的差異是由MITF 基因第11 外顯子的缺失[9]引起的，推測可能是MITF 基因的突變導致基因轉錄和翻譯效率降低，引起蛋白功能、活性和空間構象的改變，另外由于MITF 基因調控黑色素合成過程[10]，雖然非編碼區突變不會引起氨基酸的改變，但因改變了堿基組成，有可能影響轉錄，也可能存在對基因表達的影響，因此推測朝鮮鵪鶉群體中被毛顏色表現較深可能與群體中等位基因A 或B為優勢基因有關。3′UTR 區域SNP 位點的同義突變雖未改變氨基酸結構，但可能改變MicroRNA 結合，導致基因轉錄活性發生改變，因此具有進一步的研究價值。

4 結論

本試驗對朝鮮鵪鶉MITF 基因的部分序列進行多態性分析，結果顯示，位于MITF 基因外顯子4 的突變位點（c.589A＞G)使得賴氨酸變為谷氨酸，該突變與朝鮮鵪鶉的羽色存在顯著關聯性，另外位于3′UTR 處的c.2275C＞T 突變也與朝鮮鵪鶉的羽色存在顯著關聯性，但其具體的影響機制需進行下一步深入研究。