高強度間歇訓(xùn)練對肥胖大鼠心肌肌肉生長抑制素的影響

崔 軍

（南京體育學(xué)院 研究生院，江蘇 南京 210014）

早在1948年，世界衛(wèi)生組織（WHO）就將肥胖列入慢性代謝性疾病名單［1］。肥胖能夠增加心力衰竭、糖尿病、高血壓等疾病的發(fā)病風(fēng)險，從而誘發(fā)心血管、腦、腎以及其他相關(guān)疾病較高的發(fā)病率和死亡率［2-4］。由此可見，肥胖與心血管疾病密切相關(guān)。進一步研究表明，肥胖可通過改變神經(jīng)體液因素和血流動力學(xué)因素引起左心室肥厚、左心室功能障礙、心功能降低、心腔變小等心臟功能和結(jié)構(gòu)的變化，從而誘發(fā)心梗、心力衰竭以及其他心臟疾病［5-7］。

高強度間歇訓(xùn)練（High Intensity Interval Training，HIIT）是一種與持續(xù)有氧耐力訓(xùn)練相區(qū)別的訓(xùn)練方式，通常采用90%的最大攝氧量或全力沖刺狀態(tài)下多次、短時間、高強度標(biāo)準進行，間歇期運動強度較低或完全休息，單次運動時間及間歇時間可持續(xù)幾秒到幾分鐘不等［8］。相比于中等強度持續(xù)訓(xùn)練，高強度間歇訓(xùn)練在改善冠心病病人心肺功能［9］、心力衰竭病人左心室舒張功能［10］等方面優(yōu)勢更為顯著。

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）是一種分泌蛋白，主要分布在骨骼肌中，心肌和脂肪等組織中也有分布［11］。MSTN在骨骼肌中的表達受到運動的影響，短期的抗阻訓(xùn)練、高強度的靜力牽拉訓(xùn)練、有氧訓(xùn)練、負重訓(xùn)練等均可以降低骨骼肌中MSTN的表達［12］。卵泡抑素（Follistatin，F(xiàn)ST）作為骨骼肌中MSTN三條信號通路之一，在Smad信號通路上可以直接與MSTN的C-末端相結(jié)合，阻止下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的單鏈糖蛋白，從而對MSTN的表達產(chǎn)生強烈的抑制作用。有學(xué)者推測，心肌MSTN的信號通路與作用機制可能與骨骼肌中相同，所以運動對心肌MSTN蛋白表達的影響也應(yīng)該與骨骼肌中相同，但尚且存在爭議。MSTN作為肌肉生長的負調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控心肌肥大方面起著不可替代的作用。運動干預(yù)作為藥物治療以及手術(shù)治療之后的一種新的治療方式，在調(diào)節(jié)心肌MSTN的分泌以預(yù)防肥胖人群發(fā)生病理性心肌肥大、降低因肥胖而誘發(fā)的心血管疾病風(fēng)險等方面具有重要意義，因此選擇適宜的運動方式和運動強度尤為重要。鑒于上述，本研究設(shè)計通過高強度間歇游泳訓(xùn)練對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠進行運動干預(yù)，以探究MSTN在其心肌中的變化，為預(yù)防肥胖并發(fā)癥、研究MSTN在心肌中的作用機制和信號通路提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

本研究選用33只3周齡SPF級雄性SD大鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2021—0005。自由進食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境室溫24±4℃，濕度50%±10%，每日定時通風(fēng)，定期更換墊料和消毒。

對購進大鼠使用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，稱重；隨機選取24只大鼠用高脂飼料進行喂養(yǎng)，其余9只大鼠用普通飼料進行喂養(yǎng)。喂養(yǎng)至第6周，稱重并記錄。此時，以高脂飼料喂養(yǎng)組大鼠的平均體重為543.32g，以普通飼料喂養(yǎng)組大鼠的平均體重為449.77g。肥胖模型判斷標(biāo)準：高脂飲食組大鼠平均體重大于普通飲食組大鼠平均體重的20%［13］，因此成功建立肥胖大鼠模型。將建模成功后的肥胖大鼠隨機分為高脂飲食對照組（HS，n=9）、高脂飲食間歇訓(xùn)練組（HI，n=15）。

1.2 運動干預(yù)方案

本實驗采用大鼠尾部負重游泳法，對高脂飲食間歇訓(xùn)練組（HI）肥胖大鼠適應(yīng)性訓(xùn)練一周后，進行為期8周的高強度間歇游泳訓(xùn)練，并根據(jù)每只肥胖大鼠的體重調(diào)整尾部負重。第一至四周，負重分別為每只肥胖大鼠體重的5%、7%、8%、10%，每日進行5組游泳訓(xùn)練，每組訓(xùn)練時長為1min，間歇休息1min；第五至八周，負重分別為每只肥胖大鼠體重的13%、14%、15%、16%，每日進行14組游泳訓(xùn)練，每組訓(xùn)練時長為20s，間歇休息10s。訓(xùn)練室內(nèi)溫度24±4℃，水池深度55±5cm，水溫28±2℃。具體訓(xùn)練方案見表1。

表1 高強度間歇游泳訓(xùn)練方案［14］

1.3 樣本采集

8周訓(xùn)練結(jié)束后，HS組和HI組肥胖大鼠均禁食過夜，自由飲水，于次日稱量肥胖大鼠體重后取材。通過腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉（30mg/kg）的方式將肥胖大鼠進行麻醉后，仰臥固定在實驗臺，打開胸腔，立即摘取肥胖大鼠心臟，用濾紙吸干并稱重記錄，將摘取的心臟組織裝管后立刻放入液氮中冷凍暫存，最后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中進行保存。

1.4 測試指標(biāo)

1.4.1 稱重指標(biāo)

待麻醉后稱量所有肥胖大鼠的體重并記錄；處死肥胖大鼠之后，即刻摘取心臟，用濾紙吸干后稱重記錄。

1.4.2 MSTN和FST蛋白表達測定

取0.1g心肌組織，采用膜蛋白試劑盒（碧云天）提取組織上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）進行總蛋白定量，以5μg/μL的蛋白濃度進行分裝后保存于-80℃冰箱中。采用SDS—PAGE凝膠配制試劑盒（凱基生物）制膠，配制5%濃縮膠和10%分離膠，MSTN和FST的上樣量分別為3μL和7μL，置于電泳液中，在恒壓100V條件下電泳90min。先在甲醇中浸泡PVDF膜約30s，隨后轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)印緩沖液中，在冷卻且恒壓70V條件下，轉(zhuǎn)印90min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，裁取PVDF膜所需部分置于封閉液（含5%脫脂奶粉）中進行封閉，時間為90min。

1）一抗雜交：MSTN（GDF-8）和FST均以1:1 000的比例進行稀釋，內(nèi)參GAPDH以1:4 000的比例進行稀釋，見表2。

表2 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）實驗中的一抗信息

2）二抗雜交：二抗雜交采用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（碧云天，貨號：081618181105），稀釋比例為1:1000。

3）檢測信號：采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天），嚴格按照說明書進行操作，制備約1ml ECL工作液（內(nèi)參曝光時，ECL工作液需用雙蒸水按1:1的比例進行稀釋），室溫下，轉(zhuǎn)印膜遮光孵育1min。將多余的ECL工作液去掉，再用保鮮膜密封好轉(zhuǎn)印膜，放置于暗盒中，X-ray film（華東醫(yī)藥）曝光處理1-10min后，顯影和定影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究中MSTN和FST蛋白表達指標(biāo)用Imag J軟件進行處理，采用Excel、SPSS20.0和GraphPad Prism8.0.2等軟件對所得到的定量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理和分析，MSTN蛋白表達、FST蛋白表達、體重、心重等指標(biāo)數(shù)據(jù)均采用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，顯著差異選擇p＜0.05和p＜0.01水平。

2 研究結(jié)果

HS組肥胖大鼠實驗過程中無死亡，HI組肥胖大鼠8周訓(xùn)練過程中溺亡1只。

2.1 HS組和HI組體重與心重指標(biāo)的比較

從表3可知，兩組肥胖大鼠第8周訓(xùn)練結(jié)束后，HI組肥胖大鼠的體重較HS組顯著降低（p＜0.001），但心重?zé)o顯著變化（p＞0.05）。由圖1和圖2分別顯示的兩組肥胖大鼠體重和心重指標(biāo)的情況表明，與HS組相比，HI組肥胖大鼠體重顯著降低（p＜0.001），但心重?zé)o顯著差異（p＞0.05）。

表3 HS組和HI組肥胖大鼠體重、心重的比較

圖1 兩組肥胖大鼠體重比較

圖2 兩組肥胖大鼠心重比較

2.2 HS組和HI組心肌MSTN和FST蛋白表達的比較

從表4可知，HI組肥胖大鼠心肌MSTN的蛋白表達較HS組顯著增加（0.001≤p＜0.05），心肌FST的蛋白表達也顯著增加（p＜0.001）。兩組肥胖大鼠心肌MSTN蛋白的表達情況：與HS組相比，HI組肥胖大鼠心肌MSTN的蛋白表達顯著增加（0.001≤p＜0.05），見圖3；兩組肥胖大鼠心肌FST蛋白的表達情況：與HS組相比，HI組肥胖大鼠心肌FST的蛋白表達顯著增加（p＜0.001），見圖4。

表4 HS組和HI組心肌MSTN和FST蛋白表達的比較

圖3 兩組肥胖大鼠心肌MSTN/GAPDH比較

圖4 兩組肥胖大鼠心肌FST/GAPDH比較

3 討論

研究表明，肥胖能夠通過改變神經(jīng)體液因素和血流動力學(xué)因素，引發(fā)左心室肥厚和左心室功能障礙［5］，繼而改變心臟結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致心力衰竭。與此同時，肥胖還可以與糖尿病、高血壓等高發(fā)疾病相互作用，間接加重心血管的危害。運動具有促進健康的作用，運動的強度與有氧運動能力之間存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，高強度運動的心臟健康效應(yīng)比中等強度運動高出2倍之多［15］。除此之外，相比于持續(xù)性有氧訓(xùn)練，高強度間歇訓(xùn)練對運動能力、心血管病危險因素、心室重構(gòu)以及心臟舒縮功能等方面的改善效果更佳。因此，本研究選取高強度間歇游泳訓(xùn)練作為運動干預(yù)的指標(biāo)。

MSTN作為肌肉生長的負調(diào)節(jié)因子，在心肌的生長發(fā)育中扮演著重要的角色。薛霖莉［16］等的研究表明，MSTN基因在小鼠不同發(fā)育階段的心肌組織中均有表達，并且表達量存在顯著性差異，具體表現(xiàn)為小鼠幼年和性成熟階段表達量低，體成熟階段基本不表達，老年階段表達量最高，這與骨骼肌中各階段MSTN的表達是不完全一致的［17］。因此，MSTN在心肌和骨骼肌中的作用機制與信號通路也有可能存在差異。相關(guān)研究也證實上述觀點，即運動性心肌肥大時，大鼠心肌MSTN表達量顯著降低，血漿MSTN水平也顯著下降，而病理性心肌肥大、心梗、心力衰竭則會導(dǎo)致心肌MSTN的表達量顯著升高［18］；心梗大鼠在進行有氧運動訓(xùn)練后心肌MSTN的表達量顯著降低。故有學(xué)者推測，有氧運動是通過減少心肌中MSTN的表達，誘導(dǎo)心肌細胞發(fā)生生理性心肌肥大，進而改善心功能［19］。也有研究持不同觀點，自發(fā)性高血壓心力衰竭大鼠的心肌存在長期肥厚現(xiàn)象，其心肌中MSTN和FST的蛋白表達降低［20］。由此可見，心肌MSTN蛋白表達的降低不能簡單地作為心功能得到改善的評判標(biāo)準，也不應(yīng)將心肌MSTN蛋白表達的增加粗略地判定為心臟發(fā)生病理性改變的表現(xiàn)。

本研究表明，在為期8周的高強度間歇游泳訓(xùn)練后，肥胖大鼠心肌MSTN和FST表達顯著增加。這似乎與“運動訓(xùn)練可通過降低心肌MSTN的表達來提高心臟功能”的觀點相悖，而以往研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠相較于普通大鼠往往存在體重、心重顯著增加的現(xiàn)象［21］，并且隨著肥胖時間的增加，心肌肥大和心肌纖維化的程度也在不斷增加［22］。肥胖是心血管疾病的高危因素，可誘發(fā)病理性心肌肥大、心力衰竭等諸多心臟問題，心肌MSTN作為調(diào)控心肌生長發(fā)育的重要因子，經(jīng)高強度間歇訓(xùn)練干預(yù)后，其表達量顯著增加可能正是為了抑制肥胖大鼠發(fā)生病理性心肌肥大，而對心臟產(chǎn)生的一種代償性保護作用。所以肥胖大鼠在經(jīng)過高強度間歇訓(xùn)練之后心肌MSTN表達的變化與骨骼肌中的變化不同，可能與抑制病理性心肌肥大有關(guān)。

在骨骼肌中，F(xiàn)ST是MSTN 3條主要信號通路之一的Smad信號通路上能夠與MSTN的C-末端直接相結(jié)合的單鏈糖蛋白。由于FST與MSTN的直接結(jié)合，使得下游信號無法正常傳導(dǎo)，MSTN的分泌被抑制，故FST成為了MSTN的強抑制劑。同時，F(xiàn)ST還在調(diào)節(jié)能量代謝、抑制肥胖和糖尿病的發(fā)展等方面有著重要作用［23］。因此，選擇同時觀察MSTN和FST在心肌中表達的變化情況有助于進一步探究MSTN在心肌中的作用機制和信號通路。本研究中除了心肌MSTN的表達顯著增加外，心肌FST的表達也在顯著增加，這與其他學(xué)者在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的二者變化關(guān)系是一致的。這表明了MSTN在心肌中的作用機制與信號通路可能與骨骼肌中相同或類似，高強度間歇游泳訓(xùn)練有助于增加MSTN在肥胖大鼠心肌中的表達，并保護其心臟功能。與此同時，心肌FST的表達也在相應(yīng)的增高，這是為了抑制MSTN出現(xiàn)過表達，以維持正常的心臟功能。減輕體質(zhì)量可以改善左心室舒張功能，并且減重程度與左心室質(zhì)量和結(jié)構(gòu)成正比關(guān)系［24］。本研究中肥胖大鼠經(jīng)過8周高強度間歇游泳訓(xùn)練后，心重雖然未發(fā)生明顯變化，但體重卻顯著降低。相較于藥物減重、手術(shù)減重、節(jié)食減重等減重方法來說，運動減重不僅在減重效果上十分可觀，也對于肥胖者的身體健康具有明顯的益處。所以，高強度間歇游泳訓(xùn)練還可通過降低肥胖大鼠的體重，改善其心臟功能。

4 結(jié)論與建議

4.1 結(jié)論

在為期8周的高強度間歇游泳訓(xùn)練的干預(yù)下，肥胖大鼠心肌MSTN和FST的蛋白表達顯著增加，體重明顯降低，但心臟重量卻無明顯變化，原因可能在于心臟的代償性保護；在心肌中，F(xiàn)ST依然是MSTN信號通路上的拮抗劑，MSTN在心肌中的信號通路可能與骨骼肌中的相同或類似。

4.2 建議

本實驗還可再進一步進行深度研究，比如在電鏡下觀察HS組和HI組肥胖大鼠心肌組織的心肌纖維化情況或增加其他與心臟功能相關(guān)的蛋白檢測，以確定在高強度間歇游泳訓(xùn)練干預(yù)下MSTN的表達與肥胖大鼠心臟功能的具體關(guān)聯(lián)。還可以增測MSTN信號通路上其他蛋白的表達，以確定MSTN在心肌中的作用機制和信號通路是否與骨骼肌中完全相同，可為進一步探究如何通過運動訓(xùn)練對心肌MSTN進行調(diào)控來預(yù)防和治療因肥胖引起的心臟疾病提供可能性。