淺析食品微生物檢驗樣品的采集和制備

王真禎

（南平市食品藥品檢驗檢測中心，福建南平 353000）

食品微生物檢驗主要是開展樣品的采集、制備、檢驗等工作，通過檢驗分析出食品中的微生物或毒素，將其作為判定食品安全性的重要指標。食品檢驗樣品的采集與制備工作是微生物檢驗的重要前提，對于檢驗報告的出具以及檢驗結果的準確性具有重要意義，因此做好檢驗樣品的采集與制備工作尤為重要。

1 食品微生物檢驗概述

食品微生物檢驗可以有效防范人畜共患病的發生，是衡量食品是否符合食用標準的重要指標之一，也是判定食品能否食用的科學依據。通過食品微生物檢驗，可判斷出食品的真實衛生情況，能對食品的被污染程度做出合理的推斷。因此，嚴格控制食品微生物檢測各個環節，能夠顯著減少食品安全問題，對食品安全、人類健康、經濟發展起著重要 作用。

2 食品微生物檢驗樣品的采集工作要點

對食品微生物檢驗樣品進行采集，需要保證采樣的隨機性與代表性，通過微生物檢驗分析產品質量是否達到標準。因此，在樣品采集工作中，要選擇具有代表性的樣品，且取樣器件必須根據產品的類型、狀態予以確定。

2.1 明確樣品采集要求

在開展樣品采集工作前，需要明確采集要求，提前做好準備，主要包括以下7點。①在提取樣品前需要先確認貨和證完全符合。②取樣過程中應避免水、空氣、光照等不良因素的影響，防止樣品受到污染。③樣品采集過程中使用的注射器、剪刀、采血管等均需經過高溫殺菌處理，確保采樣過程中無任何污染。④通常采取隨機抽取方式采樣，如果對樣品存在微生物污染情況高度懷疑，可進行集中采集。⑤樣品采集前后，在樣品容器上粘貼標簽，標明樣品的來源、名稱、采樣時間和數量等詳細信息[1]。⑥樣品采集是微生物檢驗工作中不可缺失的步驟，實驗室必須提前保存記錄資料和程序操作，如樣品采集程序和取樣工作人員相關信息，甚至還要涵蓋設備、環境、采集地等信息。⑦完善樣品采集計劃，通過實施計劃促使樣品替代整個批次的產品，確保采集抽取機會一致。

2.2 科學確定采樣點

在食品微生物檢驗樣品采集過程中，采樣點的確定會直接影響樣品采集質量，因此對于采樣點的選擇要覆蓋食品生產到銷售的全過程，從而能夠通過檢驗結果判定哪個環節導致食品出現微生物污染[2]。從當前采樣工作情況來看，樣品采集點主要有如下3個。①食品原材料處。對食品原材料進行采樣，常見的有原料、水、添加劑等。②食品生產線。對食品生產過程中的關鍵節點開展樣品采集工作，如半成品或原胚等，主要為了掌握食品生產中微生物的變化情況；③食品倉儲。主要對食品存儲、運輸環節中的微生物變化進行采樣檢驗。通過科學確定這3個采樣點，開展針對性微生物樣品采集工作，能更精準了解不同環節下的食品狀況，判斷引發微生物污染的具體環節。

2.3 合理應用采樣方法

樣品采集方法需要結合食品類型、狀態、有無外包裝等因素確定合理的采樣方法。從食品包裝來分，可分為以下兩種情況。①包裝食品采樣。針對開袋即食型小包裝食品，為避免交叉污染，要盡量取原包裝，在檢驗之前不能開封；針對大包裝的液體食品，在采樣之前先混合，再用滅菌棒進行混合均質；針對大容器包裝的冷凍食品，則要對多部位實施無菌采樣，同時保證始終處于冷凍狀態。包裝食品的采樣要保證同一個批次和數量適中，且符合微生物檢驗標準。②非包裝食品采樣。此類食品涵蓋現場制作的散裝食品，具有一定特殊性，采樣時要保證及時性與針對性。具體來講要從多個部位實施無菌采樣，同時將各個樣品裝入不同容器中。針對散裝食品的采樣要遵循“三層五點”原則，即對表層、中層、下層的5個點進行采樣。對生產過程中的食品要進行檢驗批次的合理劃分，分別進行取樣[3]。從食品狀態來分，可分為以下兩種情況。①液態食品采樣。液態食品的采樣比較簡單，通常采樣時只需進行無菌混合，可連續或間歇攪拌，待勻質后采樣即可。②固態食品采樣。魚肉類食品要進行內外兩層采樣，其中內層采樣要避免與表層出現交叉污染。對鮮肉要用滅菌工具采樣，冷凍食品無需解凍，直接用滅菌電鉆深層采樣。

2.4 包裝密封樣品

食品微生物檢驗樣品采集完成后，要對其進行完全密封的包裝處理，必須從采樣點開始進行封裝，直至送進無菌實驗室，且途中要盡可能避免無關人員與樣品接觸，提高樣品檢驗結果的可靠性。通常會用專門的粘膠對樣品進行密封包裝，放置在特定容器中保存好，做好詳細信息記錄。

3 食品微生物檢驗樣品的制備工作要點

樣品制備是食品微生物檢驗的重要工作，是獲得準確的檢驗結果的基礎。因此，制備處理過程一定要嚴格遵守制備要求和實驗室無菌操作標準。

3.1 液體樣品制備方法

對于液體樣品可充分搖動液體，使樣品中的微生物分布均勻，然后用滅菌吸管提取25 mL液體樣品，與225 mL蒸餾水或生理鹽水混合，形成1∶10的樣品稀釋液。需要注意的是，吸管伸入樣品的深度不能大于2.5 cm。如果樣品已開瓶或開罐，必須做好表面的消毒工作，嚴格按照無菌操作要求進行操作。對于含有CO2的液體飲料先將樣品液體倒進已經殺菌完成的小瓶中，瓶口用滅菌紗布蓋住，輕微搖晃，等沒有氣體產生后再開展檢驗工作。酸性食品需用10%滅菌的NaCO3調節pH值至中性后才能開展檢驗。

3.2 半固體樣品制備方法

樣品無法用吸管直接吸取，可用滅菌容器稱取樣品25 g，加入225 mL 45 ℃的滅菌生理鹽水或蒸餾水中，此類樣品溶化后必須第一時間檢驗。從樣品稀釋到接種，切記不能超過15 min。

3.3 固體食品樣品制備方法

固體食品的處理過程比較復雜，具體處理方法有如下4類。①搗碎均質法。將100 g或以上的樣品搗碎并混合均勻，從樣品中稱取25 g投入裝有225 mL 稀釋液的無菌均質中，勻速混合1 min。此方法對大多數食品樣品有效。②剪碎振搖法。將100 g或以上的樣品剪碎并混合均勻，從樣品中稱取25 g進一步剪碎，放入帶有225 mL稀釋液和一定量玻璃珠（直徑為 5mm左右）的稀釋容器中，將瓶蓋封住，快速振搖60次。③研磨法。將100 g以上的樣品剪碎并混勻，稱取25 g投入無菌缽中進行充分研磨，研磨后放入帶有225 mL無菌稀釋液的稀釋瓶中，充分搖勻。④整粒振搖法。有自然保護膜的顆粒狀樣品，可直接稱取25 g整粒樣品投入無菌稀釋瓶中，重復上述振搖操作[4]。

3.4 特殊樣品的制備方法

樣品制備對食品微生物檢驗的結果精準度有直接影響，由于一些食品本身的物化表現、對微生物的抑制作用、酸堿性等存在特殊性，因此對于食品微生物檢驗樣品的制備方法要根據其特點進行操作。①對于酸性或堿性的樣品，先將稀釋緩沖樣液的酸堿值調成中性。②對于大蒜、洋蔥等高抑制物質或腌漬食品、酸堿性食品等，可采取緩沖蛋白胨水或其他稀釋液。③對于可可粉、奶粉等樣品，可適當地調整溫度和時間。④對于高脂肪樣品，可根據脂肪水平，在稀釋液中加入適量的聚山梨醇酯80，以促進乳化。⑤對于冷凍樣品，置于實驗室18～27 ℃ 溫度下，最多不超過3 h，在2 ℃左右不超過24 h。

3.5 樣品制備運輸

食品微生物檢驗樣品不能存放太久，且不同食品樣品對環境的要求也有顯著區別，因此在對樣品進行制備的過程中，需要結合現實情況對環境合理把控。例如，若樣品容易變質，工作人員需將其放置在干燥環境中，同時避免陽光直射，溫度最好控制在-4～0 ℃，且盡快進行檢驗；若是貝類食品，從樣品采集、運輸、制備，再到最后的檢驗工作環節，整個過程用時不能超過6 h；若是干制食品，工作人員要用塑料袋進行密封保存，防止與空氣中的水分接觸，這類食品應當在7 d內完成檢驗[5]。

4 樣品中微生物的檢驗方法

食品微生物檢驗方法多種多樣，不同被檢樣品適用于不同的方法原理，通過對不同的檢驗方法進行深刻了解，能夠為精準檢驗出食品微生物夯實基礎。微生物檢驗方法有以下幾種。①抗體檢驗。此方法應用較為廣泛，在大量的抗體檢驗方法中，最常見且應用最便捷的是酶聯免疫吸附法。它主要是利用了酶聯免疫吸附方法對金黃色葡萄球菌的高敏感性，因此在金黃葡萄球菌這一微生物的檢驗中得到大量應用。②免疫技術檢驗。該檢驗方法主要利用了抗原、抗體之間的特定結合反應，借助病原體的催化作用生成大量免疫球蛋白，實現對食品微生物的檢測。該方法對肉毒梭菌、彎曲桿菌等病原菌的檢測有著良好效果。結合工作經驗來看，免疫學技術法有精準度高、操作便捷、無需分離樣品等優點，但同時也存在假陽性過多、靈敏度低等不足，因此在選擇此檢驗方法時，需要根據實際情況合理確定。③電阻電導測定法。該方法主要是基于溶液導電率進行測定，能夠有效檢驗食品微生物的含量，利用蛋白質、糖類等大分子物質與氨基酸等小分子物質存在導電度差異的特性，合理計算出微生物含量。④快速酶促反應及代謝產物檢測法。其原理是利用細菌的高度繁殖過程產生的霉菌與指示劑反應測定微生物的數量。⑤快速檢驗法。此檢驗方法大部分已經商品化，常見的有染色成像計數法和ATP生物發光法。染色成像計數，即對細胞染色，測定樣品中的活菌數量，主要用到紫外線顯微鏡與熒光過濾膜，活細胞與死細胞分別呈現熒光橙和熒光綠。此方法的檢測時長約0.5 h，如果樣品中的細菌數量太少，則要適量增加細菌數量。ATP生物發光法的原理是混合熒光素與ATP，將微生物的ATP轉變為熒光信號，再根據熒光值判斷微生物數量。此檢測方法需 1.0 h左右，且如果微生物數量偏少，還要適量增加微生物。從效果來看，兩種方法只能對微生物數量進行檢測，無法分辨微生物種類。⑥分子生物法。該方法最常用的是核酸探針方法（即通常所說的基因探針技術）以及聚合酶鏈式反應技術。其中，核酸探針方法主要利用了基因最小分子脫氧核糖苷酸分子結構中堿基的特異性配對，用對應細菌的已知DNA序列實施同位素標記操作，添加至解旋過后的待測DNA樣品中，根據所得雙鏈DNA數量來判斷菌種數量和種類，很好地解決了微生物檢測的特異性以及敏感性問題[6]。

5 微生物檢驗過程中存在的不足及完善對策

在樣品采集與制備過程中，存在樣品存放的環境和儀器設備監管不到位，檢驗樣品的采集不具有代表性，樣品制備的設備不夠完善，食品微生物采集、制備操作不夠規范等問題。為了改善這些問題，微生物檢驗操作需要注意以下要點。

5.1 培養基質量控制

加強樣品存放和檢驗過程中的環境質量控制，進一步完善管理制度與規范實驗流程，從而實現實驗室的規范化、科學化管理，以高質量檢驗活動提高實驗室的檢驗水平。其中，需要重點關注培養基的質量控制，培養基無法單獨開展技術驗證，而需要依據微生物實驗的詳細標準展開評估，因此檢驗單位必須參照《實驗室質量控制規范》中的相關標準開展建設實驗室的工作，且在日常檢驗中嚴格遵守《微生物檢測理解與實施》中關于培養基的管理細則。對培養基的檢測可選用干熱加壓滅菌法，也可選用濕熱加壓滅菌法。

5.2 重視實驗室儀器設備的日常管理

在微生物檢驗中，檢測設備最為關鍵，會對檢驗結果的精準性造成直接影響。例如，在檢驗易揮發的樣品時，可采用干冰冷凍粉碎機對樣品進行冷凍粉碎。無菌實驗室的換氣系統必須達到潔凈廠房的等級要求，實驗室內部的墻壁、底板、天花板連接處必須帶有一定弧度，地面進行防滑處理，保證儀器設備、桌椅設施的整潔度，避免實驗人員和儀器設備、樣品等出現碰撞受損的情況。實驗室內有大量的設備設施，如水浴箱、培養箱、滅菌高壓鍋和滅菌箱等，都需要做好日常維護保養工作，定期進行清潔與消毒，確保設備的性能完好。每一次維護保養都需要進行調試記錄，并保存好相關 資料。

5.3 加強實驗人員的培訓和管理

實驗人員是實驗室作業中容易出現不規范操作的主要因素，為了規避實驗人員采用不合理的操作方法，或是因為重復實驗多次而對無菌操作觀念有所忽視，則一定要提高實驗人員的能力和思想意識。食品微生物的檢驗工作具有專業性、技術性特點，對從業者的專業素養要求非常高，可在單位內部定期開展技術人員培訓工作，保證每一位實驗人員均具備相應資質。對實驗人員的操作規范進行嚴格規定，保證對樣品的收集、制備及實驗操作均符合規定標準。此外，非實驗人員非必要不得進入無菌實驗室，必須進入時則要嚴格按照規定穿戴個體防護品。檢驗單位應當在無菌實驗室外設置醒目的警示標志，用以增強實驗人員的安全防護意識。

5.4 加強無菌室管理

必須保證微生物檢驗作業在無菌環境中進行，確保所有設備設施、作業條件均達到檢驗標準，門窗、走廊、樣品區、管理區、清潔間等均需符合《實驗室生物安全通用要求》規定的防護等級標準，對無菌室進行日常消毒，用紫外線燈進行照射滅菌，保證室內干燥且清潔。在開展檢驗工作之前，應當選擇臭氧消毒法對實驗室內部空氣中的微生物進行全面消殺，將無菌室封閉后，注入臭氧，濃度控制在 20 mg·m-3左右，靜置消殺35 min最優，再進行臭氧排放操作，濃度降至0.2 mg·m-3，隨后開展食品微生物的室內檢驗工作。

6 結語

綜上，食品微生物檢驗作為保障食品安全的關鍵環節，且微生物污染有著廣泛性、隨機性的特點，因此對檢驗工作要求較高。在食品微生物檢驗中，樣品的采集與制備屬于必要工作，其規范程度直接關系到檢驗結果的精準度，因此必須保證全程無菌操作，避免樣品被污染。樣品采集需保證代表性、時效性、完整性，樣品制備需要在嚴格條件下進行，防止出現污染和變質。樣品采集與制備工作的規范性和精準性是確保檢驗結果客觀性、公正性的前提，可為實驗結果提供保障，提升食品檢驗單位的權威性和專業性，為廣大消費者的食品安全保駕 護航。