STR基因座突變對親子鑒定準確性的影響探討

包杰 張靜 陳丹

河南省生殖健康科學技術研究院 河南事緣法醫物證司法鑒定所 河南 鄭州 450002

引言

STR即短串聯重復序列，又稱為見微衛星DNA，核心序列包括2～7bp，屬于高度串聯重復序列，重復次數在幾次到幾十次不等。短串聯重復序列符合孟德爾遺傳定律，在基因組內有著廣泛的分布，存在著高雜合度以及高度多態性，檢測難度小，在目前的法醫學遺傳標記中應用十分廣泛，完全可以滿足親子鑒定以及個體識別的應用需求。另一方面，因為STR基因座突發概率較大，在親子鑒定方面對結果的準確性也有著一定的影響，必須要謹慎對待，將其帶來的不利影響降到最低。

1 STR基因座突變規律

1.1 STR突變規律

STR基因座現在常被用于親子鑒定，但是其突變率可以達到0～7×10-3，會對鑒定結果的準確率產生影響。為排除這一影響，就需要掌握STR的突變規律，提前做好預防和處理[1]。根據研究可以確定，STR基因座突變原因是DNA復制滑動，符合逐步突變模式。每次突變只有一個重復單位被改變，在上一次突變的基礎上可以繼續發生兩個或多個單位的變化，由此可確定多步突變是逐步形成的。

1.2 STR突變步數

STR等位基因發生突變，基本上均是重復單位數的改變，每個突變均對應著一個或數個重復單位的增多/減少。超過90%的STR突變只有一個重復單位的增多/減少，為一步突變。二步突變的概率不足10%，可見多步突變的概率更小[2]。

1.3 STR突變來源

根據統計可確定STR突變主要來源于父方，可以達到母方的0.7～14倍，多數基因座為3～6倍。一旦STR基因座發生突變，將會造成重復單位數增加或減少，而這一概率父方與母方概率相同，只有較小的概率會增加重復單位。

1.4 STR突變率

影響STR基因座突變的重要因素是其多態性的高低，重復單位數目越多相應的基因座長度就越長，多態性也會更高，因此發生突變的概率更高，如D21S11、FGA等。突變率與完整重復單位連續不間斷的長度幾何平均值為正相關，甚至是指數關系。

1.5 突變的等位基因

即便是一個基因座，等位基因之間的突變概率也有著較大的差異，主要是因為等位基因的完整重復單位數不同。重復單位相同且連續相連，不被不完整重復單位打斷的較長的等位基因，發生突變的概率更高。此種重復序列在不同的位置均有可能出現復制滑動的情況。正常情況下，存在連續10個以上的重復單位更容易發生突變。

1.6 其他

隨著父親年齡的增大，STR基因組發生突變的概率會一定的增長。另外，經過觀察X和Y染色體STR突變數據，可以發現性染色體STR突變規律以及突變率與常染色體STR突變沒有明顯差異。

2 STR基因座突變后非父排除率

在不考慮突變的情況下，檢測的一系列遺傳標記中出現任何一個排除親子關系的概率即累積非父排除率。一旦STR基因組出現突變，便需要有至少兩個遺傳標記才可以排除親子關系。經過研究可以確定，檢測Power Plex 16系統允許三個基因座突變的累積費父排除率＞0.99，檢測24個STR允許三個三個基因座突變的累積費父排除率＞0.9999[3]。

3 STR基因座突變下父權指數計算

3.1 平均突變父權指數

在基因座發生突變的情況下，假如被檢測男子為真正生父，但是受突變影響出現排除親子關系分型結果的概率與突變率一致。被檢隨機男子并非生父，出現的排除親子關系分型結果的概率是非父排除率。基于PI定義分析，PI為兩種情況下概率的比值：AMPI=μ/PE。其中μ表示基因座突變率，PE表示非父排除率[4]。應用此種方法計算，最終得到的AMPI值至于PE大小相關，與被檢男子的具體基因分型并不相關。

3.2 傳遞概率計算法

傳遞概率計算法的原理于無突變情況下的PI值計算方法一致，只是突變親代傳遞等位基因給后代的概率有所改變，與等位基因的突變概率相同。此種方法計算，主要與爭議父基因型相關，需要以基因分型信息為支持，得到更具有針對性的PI值。現在對于STR基因座突變的研究越來越多，掌握了越來越多的突變數據，但是多數只能夠使用整個基因座的突變率。傳遞概率法計算則是需要應用到特異等位基因突變概率，要根據基因座突變率推算得到等位基因的突變概率才可以。由此就決定了此種方法計算過程的復雜性，實際應用中要格外注意。

3.2.1 突變模型。STR等位基因突變概率的計算模型包括等概率模型、遞減模型、成比例模型、驗性遞減模型以及逐步穩態模型。其中，等概率模型以及成比例模型均與逐步突變模型不符。遞減模型符合SMM，將突變概率和重復序列長度變化之間的關系納入到考慮范圍內，且對等位基因頻率數據庫中內有的新等位基因情況也進行了綜合分析，只是未針對與等位基因頻率之間的非穩態關系進行分析。經驗性低價模型的原理更為簡單，利用Ms表示等位基因發生s（s＞1）步突變概率，則Ms≈（1/2）（1/10）|s-1|。逐步穩態模型不僅考慮了突變概率和重復序列長度變化的關系，同時還考慮了不同等位基因突變概率有所差異的情況。此模型同時符合SMM和群體等位基因頻率穩定不變的要求，相比其他幾種模型，在基因突變概率方面的計算方面理論上應用效果最好。

3.2.2 突變率性別比。存在較多的研究表示父方與母方之間的突變概率有所差異，這樣在計算突變PI值時，也需要將此方面的突變率性別差異納入到考慮范圍內。例如Brenner按照女性突變率是男性突變率的1/3.5進行PI值計算。

3.2.3 突變方向。雖然在一些研究中STR突變多趨向于增加重復單位，但是在計算等位基因突變率時，往往都是采用突變重復序列增加或減少機會相等的算法進行計算。

3.2.4 一步突變與多步突變。部分情況下孩子等位基因是通過親代一步突變或者多步突變而來，例如母方基因型為12，13，孩子基因型為13，14，父方基因型為15，16。對于多步突變（16突變成14）的情況是否也需要納入考慮，目前尚未完全統一。但是實際上基因座發生二步甚至多步突變的概率是非常小的，以及幾乎不對對最終PI值的準確性產生影響，大多數情況對其是忽略不計的。

3.2.5 非整數步突變。假如D24S11基因座中，母方基因型為29，30，孩子基因型為30，31，父方基因型是32，33，就可以判斷存在非整數突變。但是此種非整數重復單位改變的情況下在STR基因座突變中的可能性非常小。其有可能不是重復序列的改變，而是重復序列側翼序列的改變，無論是選擇逐步穩態模型還是經驗遞減模型進行計算，均無法得到準確的等位基因突變概率，影響最終鑒定結果可靠性。

3.2.6 父、母均有突變可能性。例如母方基因型為12，13，孩子基因型為12，14，父方基因型為12，15。可以說明父母均有基因座突變的可能性，那么在進行計算時需要考慮母方的突變可能性嗎？相比來講，如果將母方突變納入到考慮范圍內，最終的計算結果將會對PI值產生明顯的影響。雖然在親子鑒定的實施中基本上是認定父方突變，但是對于部分特殊案例也有著極大的情況，不能夠完全忽視母方突變的可能性。

4 STR基因座突變對親子鑒定準確性影響注意要點

4.1 初步判定突變

在對一定數量的STR基因座進行檢測后，發現其中之后少數 幾個基因座排除親子關系的情況下，不排除存在突變的可能。一般情況下因為基因座的多態性、突變率以及親子關系認定水平等特點，對于存在的幾個的實際數量并沒有明確規定。應用PowerPlex 16與AmpFLSTR Identifler系統時，假如可以檢出15個STR的基因型，存在3個以內的基因座排除親子關系，便可懷疑存在突變。其他不排除親子關系基因座的累積非父排除率可以達到99%以上。如果存在4個及以上也無法排除STR突變的可能性，只能夠確定突變的概率比較小。

4.2 增多基因座數目

測序是可以鑒定是否存在突變的有效方法，其中需要增加檢測的遺傳標記數，可以通過累積非父排除率進行估計。累積非父排除率越高以及允許突變基因座越多的情況下，需要檢測的遺傳標記也就越多。并且，對于需要增加檢測遺傳標記的情況，依然存在著新突變發生的可能。

4.3 區分突變情形

4.3.1 沉默等位基因。如果出現親代一方與孩子全部表現為純合子的情況，如母方分型為29，30，孩子分型是30，父方分型為32，便需要注意因等位基因漏擴產生的沉默等位基因。沉默等位基因基本上均是引物和模板間不配對導致，可選擇不同引物或試劑盒檢測，還可以通過改變擴增條件來進行證實。以ISFG要求為依據，要對沉默等位基因基因座的PI值進行計算。

4.3.2 親屬個體代替檢驗。存在親緣關系的個體之間具有相同等位基因的可能性要高于隨機個體之間的概率。假如與生父存在親緣關系的個體代替生父進行親子鑒定，便有一定的可能性檢測出被檢男子與孩子之間存在個別基因座排除親子關系的可能性。但是被檢測的基因座數目越多，則出現這種情況的可能性也越低。

4.3.3 單親二體。子代一對染色體完全來自母方或父方，如果是單親二體將會導致假排除，一般需要對同一號染色體上的多個基因座進行檢測來證實。

5 STR基因座突變對親子鑒定準確性影響試驗

5.1 試驗儀器與設備

3130型自動遺傳分析儀、Identifiler plus試劑盒與9700型PCR擴增儀。

5.2 試驗方法

①DNA提取與擴增。應用Identifiler plus試劑盒進行15個STR基因座的復合擴增處理，包括D8S1179、D2S1339、D21S11、D19S433、CSF1PO、D16S539、TH01、D3S1358、FGA、D18S51、TPOX與D2S1338。 控制整個反應體系為10μL，并按照親子鑒定要求完成各項參數的設置：30℃條件小操作10min，41℃條件下處理30min，99℃下處理5min，5℃下處理5min，共進行35個循環處理，且最后的10min需要延長，調整溫度為72℃。處理后得到的產物要置于4℃條件下保存。②檢測擴增產物。應用Chelex-100提取模板BNA，并將處理得到的擴增產物經過3500DX基因分析儀完成毛細血管電泳。再利用全自動分析儀來確定親權關系。

5.3 試驗結果

用于本次試驗的親子鑒定標本共有3120份，支持親子關系的有1946份，三聯體806份，二聯體1150份，合計觀察到減數分裂共有1805次，15例基因座突變，突變率為0.83%。其中，突變率前三位基因分別是D8S1179、D21S11和D2S1339。可以確定STR在DNA合成過程中存在著比較高的突變率，造成基因突變，而對親子鑒定結果的準確性產生影響。

6 結束語

STR基因座在親子鑒定中存在著比較高的突變率，尤其是父方突變概率要高于母方。為降低突變對鑒定結果的影響，需要掌握STR基因座突變的規律，總結基因突變情況計算侵權指數，進一步提高親子鑒定的準確性。