基于網絡藥理學探究溫陽強心顆粒抗心肌缺血再灌注損傷的作用機制

原 黛，劉 群，朱姝悅，劉 暢，王冰梅，王 微

（長春中醫藥大學，長春 130117）

急性心肌梗死是一種可導致心肌缺血性壞死的心血管疾病，對梗死的心肌及時地進行血流灌注是目前最有效的治療手段，但易造成心肌缺血再灌注損傷[1]。心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI）表現為心肌缺血后再灌注血流時，不能恢復缺血部位的組織器官功能，反而還會出現超微結構的變化，心肌能量代謝障礙和血管無復流等現象，進而加重了功能障礙和結構損傷[2]。

溫陽強心顆粒具有益氣溫陽、利水消腫、活血通絡的作用。經研究發現，溫陽強心顆粒中的12味中藥材可通過不同的作用機制改善心肌缺血再灌注損傷[3]的癥狀。目前運用于治療心肌缺血再灌注損傷的中藥制劑一般是由三七-紅花藥對、干姜-附子湯、苓桂術甘湯等由2～5種中藥組成的復方。相較于這些中藥復方，溫陽強心顆粒復方中增加了黃芪、川芎等中藥，其中的黃酮類成分具有改善血液循環等作用。溫陽強心顆粒復方成分多，其中的12味中藥都具有抗心肌缺血再灌注損傷的作用，但是，其具體作用機制還未可知。本研究通過網絡藥理學從系統、整體的水平探討溫陽強心顆粒治療心肌缺血再灌注損傷的作用機制，為溫陽強心顆粒對心肌缺血再灌注損傷的臨床治療提供合理依據[4]。

1 材料與方法

1.1 溫陽強心顆粒中活性成分和作用靶點的篩選 利用中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP）搜索中藥名字得到溫陽強心顆粒中附子、黨參、當歸、川芎、丹參、黃芪、三七、茯苓、白術、桂枝、甘草、葶藶子這12味藥材的所有化合物成分，將口服生物利用度（OB）的篩選條件調整為≥30%、將化合物類藥性（DL）的篩選條件調整為≥0.18，篩選出活性成分，并獲取活性化合物的所有作用靶點。利用蛋白質數據庫（Uniprot Database）下載已驗證的人類基因數據庫并進行處理，用以方便后續的網絡藥理學研究。

1.2 構建靶點蛋白交互作用（protein protein interaction，PPI）網絡 將上述交集靶點輸入蛋白質相互作用數據庫（STRING）得到高置信度的靶點蛋白交互作用（PPI）信息，用Cytoscape 3.9.1軟件將PPI信息進行網絡構建，對所有數據進行連接度（Deegre）值分析，以Deegre值對靶點圖形大小，色彩進行調整進而得到PPI網絡，利用Centiscape 2.2軟件進行拓撲分析，分析出所有交集靶點的緊密度（closeness centrality，CC）、Degree和介度（betweenness centrality，BC）3個參數值做中位值，再通過BC、CC和Degree值篩選核心靶點。

1.3 GO 富集分析和KEGG通路富集分析 將藥物疾病交集靶點基因進行基因本體（GO）富 集分析，包括分子功能（MF）分析、生物過程（BP）分析、細胞組成（CC）分析，然后進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。

2 結果

2.1 溫陽強心顆粒的有效成分及作用靶點 從TCMSP數據庫中篩選出了溫陽強心顆粒的277個化合物，去除重復項以及無對應靶點的化合物后總計檢索出192個有效成分。其中：附子3個，黨參11個，川芎2個，丹參54個，黃芪7個，三七1個，茯苓5個，白術3個，桂枝4個，甘草78個，葶藶子3個，共同有效成分21個。從TCMSP數據庫匹配到對應的作用靶點，將其從UNIPROT數據中進行匹配，轉換成Uniprot ID基因名，得到了溫陽強心顆粒藥物有效成分所對應的作用靶點基因共285個。在GeneCards數據庫中篩選到MI/RI相關作用靶點1 387條，篩選設置relevance score≥15，最終得到相關靶點一共173個。利用微生信網站中的Ⅴenn作圖平臺，將藥物作用靶點和MI/RI相關靶點取交集后最終得到65個靶點。

2.2 構建靶點蛋白交互作用PPI網絡 使用STRING數據庫和Cytoscape 3.9.1軟件得到了一張具有65個節點、1082條邊的PPI網絡圖，如圖1所示。經過Centiscape 2.2軟件拓撲分析后得到 Degree中位數為33.81，BC中位數為30.69，CC中位數為0.011，滿足以上3個參數值的是白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素1B（IL-1B）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）等21個可以作為在治療心肌缺血再灌注損傷中發揮作用的核心靶點[7-8]，這些靶點可能在心肌缺血再灌注損傷的治療中發揮了重要作用[9]，詳細如表1所示。

表1 溫陽強心顆粒抗MI/RI的靶點蛋白交互作用PPI網絡

圖1 PPI可視化網絡圖

2.3 GO富集分析 在Matescape平臺對得到的65個交集靶點蛋白進行BP、CC、MF富集分析，以P＜0.01為標準進行篩選，富集到了297條生物過程條目、64條細胞組成條目、72條分子功能條目，共計433條GO條目，各類別前10個條目如圖2所示，其中生物過程主要包括有：正調控細胞遷移、對脂多糖的反應、對氧化的應激反應等；細胞組成主要包括有：膜灶、膜微結構域、細胞膜內陷、囊泡腔、外側細胞膜、質膜灶、分泌顆粒腔、細胞質囊泡腔、蛋白酶抑制劑復合物等[10]；分子功能包括有：細胞因子活性、細胞因子受體結合、信號受體激活活動、信號受體調節活動等[11]。通過以上數據可以發現，溫陽強心顆粒可能是通過多種生物學過程發揮治療MI/RI疾病作用。

圖2 GO生物過程、細胞組成、分子功能

2.4 KEGG通路富集分析 在Matescape平臺對得到的65個交集靶點進行KEGG信號通路富集分析，以P＜0.01為標準進行篩選，共富集得到154條信號通路，主要包括：流體剪切應力與動脈粥樣硬化、TNF信號轉導通路、白細胞介素（IL-17）信號通路、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號轉導通路、血管內皮生長因子（ⅤEGF）信號轉導通路、內分泌性信號通路、Th17細胞分化信號通路、細胞因子-細胞因子相互作用信號通路、細胞衰老信號通路、壞死性凋亡信號通路等信號轉導通路，且這些信號通路與膀胱癌（bladder cancer）、胰 腺 癌（pancreatic cancer）、直腸癌（colorectal cancer）、小細胞肺癌（small cell lung cancer）等癌癥通路有相關性；也與肺結核（tuberculosis）、非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease）、酒精性肝病（alcoholic liver disease）、類風濕性關節炎（rheumatoidarthritis）等疾病通路有相關性[12]。分析以上研究結果可知，溫陽強心顆粒的活性成分相關靶點分布于不同途徑，能夠通過各個信號通路協調發揮對MI/RI的治療作用[13]。

3 討論

心肌缺血是心肌異常代謝導致能量不足以支持心臟正常工作的病理狀態，是由于心臟的血液灌注量降低導致心臟供氧降低而形成的疾病[14]，血運重建治療法是現在臨床上治療心肌缺血的主要方法[15]。但是恢復缺血部位心肌組織的血流供應后，心肌可能會更大程度受損進而導致心肌組織的二次損傷。大量研究結果顯示缺血再灌注損傷心肌可占全部梗死心肌面積的50%[16]。

本研究共獲得了以下核心靶點：IL-6、TNF、IL-1B、AKT1、ⅤEGFA、CCL2、NOS3、MMP9和IL-10等。在溫陽強心顆粒抗心肌缺血再灌注損傷的GO富集分析中主要涉及297條生物學過程，包括正調控細胞遷移、對脂多糖的反應、對氧化應激的反應、炎癥反應、對無機物質的反應和細胞對化學的應激反應等大部分生物過程都和心肌缺血再灌注損傷相關[17]。在溫陽強心顆粒抗心肌缺血再灌注損傷的KEGG通路富集分析中，主要涉及AGE-RAGE信號通路、TNF信號轉導通路、IL-17信號通路、HIF-1信號轉導通路和ⅤEGF信號轉導通路等通路[18]。在心肌缺血再灌注損傷這一疾病的發展過程中，炎癥因子TNF-α水平的增加與心肌組織的功能降低有關系，通過直接影響心肌的收縮力從而抑制心肌細胞的凋亡，這是TNF-α導致心肌缺血后心肌功能降低的主要機制[19]，相關研究表明，IL-23、IL-17等其他炎性因子在心肌缺血再灌注損傷中的表達明顯提高，與心肌細胞凋亡、提高炎性反應和氧化應激等有相關性[20]。研究證明，激活HIF-1α可以通過調控Bax/Bcl-2表達以及與Caspase-3和Caspase-9活性相關的心肌細胞凋亡，從而有效減輕糖尿病心臟I/R后的心肌損傷程度[21]，增強ⅤEDF的表達，抑制心肌缺血時脂質的過氧化，從而促進清除氧自由基，促進缺血部位新生血管的生成，對大鼠實驗性心肌缺血再灌注損傷也具有保護作用[6]，NF-kB信號通路是I/R損傷的介質。NF-kB激活會造成炎癥因子（如TNF-α，IL-1，IL-6和IL-8），趨化因子（例如MCP-1和MIP-1a）以及產生繼發性炎癥介質（例如COX-2和iNOS）的誘導酶的表達增強[20]。這是一個惡性循環，會擴大初始炎癥反應，這是I/R損傷的重要機制[21]。有關研究報道，AGE與其細胞表面受體RAGE的結合導致NF-kB介導的炎癥因子釋放[22]，有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號通路參與I/R損傷過程，通過P38MAPK、P44/42MAPK和SAPK/JNK 3條途徑調節細胞免疫、炎癥和凋亡[23]。根據這些研究推測溫陽強心顆粒可能是通過作用于這些通路來發揮治療心肌缺血再灌注損傷的作用。

本研究應用了網絡藥理學技術研究了溫陽強心顆粒中所含中藥的所有化學成分及其作用靶點，多角度分析總結得到其抗心肌缺血再灌注損傷具有多成分、多靶點、多生物過程、多信號通路的作用機制，但其具體的作用機制還有待進一步探討。