西樂葆對重癥肺炎小鼠ANXA1/FPR2通路及炎癥反應的影響

陳少英 晏平陳貴斌蔣敏鐘智成張志文（廣州醫科大學附屬第一醫院急診科，廣州 520120）

肺炎是最常見的傳染性呼吸道疾病，具有很高的發病率和病死率，特別是在兒童和老年人中，伴有發燒、咳嗽、呼吸急促、胸痛等非典型的臨床癥狀，嚴重者甚至導致呼吸衰竭和心力衰竭［1-3］。西樂葆又稱塞來昔布（Celecoxib），是一種非甾體抗炎藥，常用于治療類風濕關節炎。在H7N9病毒引起的重癥肺炎中發現，扎那米韋和塞來昔布聯合應用可明顯改善肺部病理損傷［4］。膜聯蛋白A1（Annexin A1，ANXA1）是一種糖皮質激素誘導型蛋白，通過與G蛋白偶聯受體家族中的N-甲酰肽受體2（N-formyl peptide receptor 2，FPR2）作用，減輕炎癥性臨床疾病模型中的炎癥和免疫細胞激活［5］。GAVINS等［6］研究發現，ANXA1/FPR2系統在抑制LPS誘導的腦炎癥中具有重要作用。但目前關于該系統與肺炎間的關系尚未見報道。因此本研究擬構建肺炎克雷伯桿菌感染的小鼠重癥肺炎模型，探究西樂葆對其的藥效，以及ANXA1/FPR2系統所發揮的作用，為肺炎的臨床治療提供新的治療靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物BALB/c小鼠120只，雌雄各半，體質量18~22 g，購自揚州大學，許可證號：SYXK（蘇）2017-0044。所有動物飼養于（22±2）℃，12 h光/暗循環條件下，自由進食飲水。所有實驗均按照廣州醫科大學附屬第一醫院制定的實驗動物護理和使用指南的指導方針進行，并經廣州醫科大學附屬第一醫院動物護理和使用委員會批準。

1.1.2 主要試劑西樂葆（塞來昔布，純度≥99%，貨號：C9180）購自北京索萊寶生物有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：C1091）、HE染色試劑盒（貨號：C0105）購自上海碧云天生物科技有限公司；髓過氧化物酶（MPO）ELISA試劑盒（貨號：ab275109）、IL-6 ELISA試劑盒（貨號：ab178013）、IL-1βELISA試劑盒（貨號：ab197742）、TNF-αELISA試劑盒（貨號：ab181421）均購自美國Abcam公司；ANXA1一抗（貨號：32934）、β-actin一抗（貨號：58169）及二抗（貨號：7076）購自美國Cell Signaling公司；FPR2一抗（貨號：HPA029154）購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 實驗儀器分析電子天平購自德國Sartorius公司；酶標儀購自瑞士TECAN公司；光學顯微鏡購自日本Nikon公司；蛋白電泳儀購自北京六一儀器廠；凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 重癥肺炎小鼠動物模型制備將培養至生長對數期的肺炎克雷伯桿菌稀釋呈1.5×109CFU/ml備用。將小鼠麻醉固定，在氣管內滴注0.15 ml肺炎克雷伯桿菌液，輕輕翻轉小鼠，使菌液在小鼠肺臟內均勻分布。若小鼠呼吸急促，動脈血氧分 壓≤60 mmHg，X線檢查可見兩肺彌漫性滲出影，表明小鼠重癥肺炎模型建立成功［7］。

1.2.2 動物分組及給藥將造模成功的100只BALB/c小鼠隨機分為5組：模型組、西樂葆低劑量組、西樂葆中劑量組、西樂葆高劑量組和地塞米松組，每組20只。另設20只小鼠給予0.15 ml生理鹽水滴注為對照組。按照實驗動物用藥劑量換算［4］，西樂葆低、中、高劑量組小鼠分別按照1.5 mg/kg、3 mg/kg、6 mg/kg劑量腹腔注射，地塞米松組小鼠以1.04 mg/kg劑量腹腔注射［8］。對照組和模型組小鼠給予生理鹽水，注射體積0.1 ml/10 g，1次/d，連續7 d。

1.2.3 小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞計數 末次給藥24 h后，將各組小鼠麻醉處死，打開胸腔，使用預冷的PBS對小鼠肺臟進行支氣管肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。離心回收細胞，涂片，經Diff-Quick染色后，光學顯微鏡下進行炎癥細胞分離及計數。

1.2.4 肺質量及肺指數測定處死各組小鼠前，稱量小鼠體質量并記錄。收集BALF后，快速完整取出小鼠肺組織，濾紙吸干表面水分后稱重。肺指數（%）=（肺重/體重）×100%。

1.2.5 肺水腫評估和肺組織MPO測定各組小鼠隨機選擇6只，取右肺組織，濾紙吸干表面水分稱濕重（W），然后在60℃烘箱中烘烤48 h至恒重，稱干重（D），計算W/D［9］。測得W/D后，將小鼠左肺組織研磨勻漿，37℃水浴15 min，按照ELISA試劑盒說明書操作方法檢測肺組織中MPO活性。

1.2.6 肺組織病理學檢測各組剩余6只小鼠，左肺置于4%甲醛中固定，右肺液氮速凍。左肺組織固定48 h后，脫水透明，包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察，分析小鼠肺組織病理學變化。

1.2.7 TUNEL法檢測各組小鼠肺組織中細胞凋亡情況利用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測小鼠肺組織細胞凋亡情況。從每組小鼠肺組織中隨機選擇5張切片，并在高倍鏡下（×400）選擇5個視野，觀察計數染色后的陽性細胞數，細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.2.8 小鼠肺組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平測定取出液氮速凍的肺組織，研磨勻漿，采用ELISA試劑盒檢測肺組織勻漿中IL-6、IL-1β、TNF-α水平［10］。

1.2.9 Western blot檢測蛋白表達水平提取小鼠肺組織勻漿中總蛋白，BCA法對蛋白進行定量分析。取20μg用于SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜后封閉，孵ANXA1、FPR2一抗，4℃過夜，洗膜加二抗，室溫孵育2 h，洗膜，顯色曝光，使用凝膠成像系統進行觀察，以β-actin為內參蛋白，分析目的條帶表達水平。

1.3 統計學分析采用SPSS22.0軟件進行統計分析，數據以±s表示，進行t檢驗以比較各組間差異。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 西樂葆對重癥肺炎小鼠肺指數的影響如圖1所示，與對照組相比，模型組小鼠肺指數顯著升高（P<0.05）；西樂葆各處理組及地塞米松組小鼠肺指數顯著降低（P<0.05）。

圖1 各組小鼠肺指數比較Fig.1 Comparison of lung index of mice in each group

2.2 西樂葆對重癥肺炎小鼠肺水腫和肺組織MPO活性的影響與對照組相比，模型組小鼠肺組織W/D、MPO活性顯著升高（P<0.05）；西樂葆各處理組及地塞米松組小鼠肺組織W/D、MPO活性顯著降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠肺水腫和肺組織MPO活性的比較Fig.2 Comparison of pulmonary edema and MPO activity of lung tissue in each group of mice

2.3 西樂葆對重癥肺炎小鼠BALF中炎癥細胞數的影響與對照組相比，模型組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數量顯著增多（P<0.05）；西樂葆各處理組及地塞米松組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數顯著降低（P<0.05，表1）。

表1 各組小鼠BALF中炎癥細胞數比較（±s，n=10，×104 cells/ml）Tab.1 Comparison of number of inflammatory cells in BALF of mice in each group（±s，n=10，×104 cells/ml）

表1 各組小鼠BALF中炎癥細胞數比較（±s，n=10，×104 cells/ml）Tab.1 Comparison of number of inflammatory cells in BALF of mice in each group（±s，n=10，×104 cells/ml）

Note：1）P<0.05 vs control group，2）P<0.05 vs model group.

Groups Control Model Celecoxib low-dose Celecoxib medium-dose Celecoxib high-dose Dexamethasone Neutrophils 0.05±0.14 3.89±0.511）2.76±0.342）1.53±0.272）0.84±0.182）1.18±0.212）Eosinophils 0.04±0.16 158.41±7.691）132.48±5.732）90.64±3.522）66.23±2.472）78.43±1.952）Lymphocytes 0.23±0.47 51.62±6.381）40.26±5.672）25.82±2.642）16.71±2.312）20.41±3.022）Macrophages 3.56±0.82 38.42±1.581）35.21±1.05 34.86±1.26 34.56±1.37 34.62±1.40

2.4 西樂葆對重癥肺炎小鼠肺組織結構的影響對照組小鼠肺組織結構正常，肺泡壁和肺泡結構完整，無水腫現象；模型組肺泡大小不等，肺泡壁和肺泡隔結構破壞，肺泡間隔增厚，可見明顯充血，并伴有大量炎癥細胞浸潤；西樂葆各劑量組與模型組相比，肺泡壁和肺泡隔結構得到一定程度的修復，炎癥細胞浸潤減少，且隨著西樂葆劑量增大，肺組織損傷程度降低。見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織HE染色（×200）Fig.3 HE staining of lung tissue of mice in each group（×200）

2.5 西樂葆對重癥肺炎小鼠肺組織細胞凋亡率的影響與對照組相比，模型組小鼠肺組織細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；西樂葆處理組及地塞米松組小鼠肺組織細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織細胞凋亡比較Fig.4 Comparison of cell apoptosis in lung tissue of mice in each group

2.6 西樂葆對重癥肺炎小鼠肺組織中炎癥因子水平的影響與對照組相比，模型組小鼠肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P<0.05）；西樂葆處理組及地塞米松組小鼠肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著降低（P<0.05，表2）。

表2 各組小鼠肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平的比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of IL-6，IL-1βand TNF-αlevels in lung tissues of mice in each group（±s，n=10）

表2 各組小鼠肺組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平的比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of IL-6，IL-1βand TNF-αlevels in lung tissues of mice in each group（±s，n=10）

Note：1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs model group.

Groups Control Model Celecoxib low-dose Celecoxib medium-dose Celecoxib high-dose Dexamethasone IL-6/（pg·ml-1）11.86±0.72 62.57±1.591）45.83±1.132）36.18±0.942）23.64±1.052）27.55±1.122）IL-1β/（ng·ml-1）0.31±0.09 1.54±0.161）1.37±0.122）1.04±0.092）0.76±0.112）0.87±0.132）TNF-α/（ng·ml-1）0.26±0.08 1.72±0.151）1.50±0.172）1.24±0.132）0.91±0.082）1.12±0.112）

2.7 西樂葆對重癥肺炎小鼠肺組織中ANXA1、FPR2蛋白表達的影響與對照組相比，模型組小鼠肺組織ANXA1、FPR2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）；西樂葆處理組及地塞米松組小鼠肺組織ANXA1、FPR2蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。見圖5。

圖5 各組小鼠肺組織中ANXA1、FPR2蛋白相對表達水平Fig.5 ANXA1 and FPR2 protein expression levels in lung tissues of mice in each group

3 討論

肺炎是一種炎癥性疾病，其特征是包括細菌、病毒和真菌在內的病原體下呼吸道感染［11］。眾所周知，肺炎與微生物病原體（內毒素等）的炎癥刺激有關，是嚴重肺炎的誘因之一［12-13］。本研究利用肺炎克雷伯桿菌構建小鼠重癥肺炎模型，結果發現，小鼠肺組織肺泡壁和肺泡隔結構破壞，肺泡間隔增厚，可見明顯充血，并伴有大量炎癥細胞浸潤，小鼠肺指數、細胞凋亡率、W/D、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數及IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高，提示模型建立成功。MPO為血紅素過氧化物酶超家族的成員，主要表達于嗜中性粒細胞和單核細胞［14］。MPO活性升高與機體的炎癥反應和氧化應激增加有關［15］。模型小鼠肺組織的MPO活性較對照組顯著升高，表明重癥肺炎小鼠的炎癥和氧化應激反應增強，肺組織損傷嚴重。

西樂葆（塞來昔布）是一種COX-2選擇抑制劑，已應用20余年，特別是作為抗炎藥物。LIU等［16］研究發現，西樂葆可通過抑制NF-κB活性減輕高氧支氣管肺發育不良大鼠的肺損傷。西樂葆還可降低LPS誘導的大鼠氣管高反應性和肺部炎癥反應［17］。本研究中，在西樂葆作用下，重癥肺炎小鼠肺泡壁和肺泡隔等肺組織結構得到一定程度的修復，炎癥細胞浸潤減少，小鼠肺指數、細胞凋亡率、W/D、MPO活性及嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數均顯著降低，表明西樂葆可減少肺炎小鼠炎癥反應，減輕肺組織病理變化。在實驗性骨關節小鼠模型中研究發現，西樂葆與RA10-6聯合可明顯抑制滑膜組織中IL-6表達減輕炎癥反應［18］。西樂葆和鋰共同用藥可減少躁狂癥動物模型中的炎癥參數，降低IL-1β、TNF-α水平［19］。本研究中，西樂葆處理組肺組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低，表明西樂葆可明顯減輕肺炎小鼠肺組織的炎癥反應。

ANXA1是一種特殊的內源性抗炎蛋白，受糖皮質激素調節，已被證明在先天免疫系統和獲得性免疫系統中介導炎癥［20］。FPR2是一種模式識別受體，除了促炎性病原體衍生化合物外，還識別抗炎內源性配體ANXA1［21］。ANXA1-FPR2信號軸具有主要抗炎作用，ANXA1主要通過調節FPR2誘導炎癥消退。ANXA1可通過FRP2促進宿主防御，從而控制肺炎鏈球菌肺炎期間的炎癥和細菌傳播［22］。本研究在重癥肺炎小鼠肺組織內觀察到ANXA1、FPR2蛋白表達水平顯著降低，表明ANXA1、FPR2蛋白缺失可加劇小鼠炎癥反應。在西樂葆處理后，重癥肺炎小鼠肺組織ANXA1、FPR2蛋白表達水平顯著升高，表明西樂葆可減輕重癥肺炎小鼠炎癥反應，可能與促進ANXA1、FPR2蛋白表達有關。

綜上所述，重癥肺炎小鼠在西樂葆作用下，炎癥反應和肺組織損傷明顯減輕，可能與激活ANXA1/FPR2信號通路有關。然而，肺炎的發病機制比較復雜，西樂葆的藥效仍有待進一步研究。