基于HMGB1/Beclin-1信號通路探討溫陽利水通絡法對腎病綜合征模型小鼠TNF-α、IL-4、IL-8的作用機制①

吳鵬公 敏黃琳 曾冬梅 吳洪皓 邱家廷（江西省贛州市中醫院，贛州 341000）

腎病綜合征是由感染、遺傳、免疫等多種病因引起的臨床腎臟疾病綜合征，其主要臨床癥狀表現為大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫和高脂血癥等［1-3］。腎病綜合征往往伴有腎小球濾過膜損傷、腎小球基膜通透性增加等病理生理狀態，其病因復雜多變，患病率和發病率也呈逐年增長趨勢［4-5］。micro RNAs是一種小型非蛋白質編碼的單鏈RNA，在組織中轉錄調控目標基因表達。相關資料記錄到，microRNA參與了包括細胞發育、凋亡和自噬在內的一系列過程［6-7］。現有研究表明，miR-141與HMGB1/Beclin-1間的平衡是影響腎病綜合征發生發展的重要原因［8］。腎病綜合征的治療以糖皮質激素、烷基化劑及環孢霉素等免疫抑制劑預防、延緩腎功能進行性惡化為主，這些療法雖能緩解臨床癥狀、預防并發癥，但均出現不良反應［9］。目前，中醫藥在治療腎病綜合征上具有一定的優勢。溫陽利水通絡法是中醫藥方，具有溫陽利水的功效，本文旨在研究溫陽利水通絡法調控HMGB1/Beclin-1信號通路對腎病綜合征的治療效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物30只小鼠［許可證號：SCXK（京）2016-0006；倫理號：IACUC-DWZX-2020-627］，雄性，SPF級，體質量（30±2）g，購于醫學實驗動物基地，集體飼養，鼠籠安靜整潔，室內溫度保持在15~25℃，空氣流通干燥。

1.1.2 藥品及試劑茯苓30 g、黃芪30 g、銀杏葉20 g、附子15 g、白術15 g、赤芍15 g、紅參10 g、豬苓10 g、川芎10 g、干姜10 g、甘草6 g，置于涼水中浸泡1 h，煎煮30 min后濃縮為2 g/ml。鹽酸阿霉素（25316-40-9，深圳萬樂藥業有限公司），兔抗小鼠HMGB1抗體，山羊抗小鼠Beclin-1抗體，兔抗小鼠LC3（英國Abcam公司）；TNF-α、IL-4、IL-8 ELISA Kits（北京百智生物科技公司）。

1.1.3 儀器全自動生化分析儀（BK-200，江蘇英諾華醫療技術有限公司）；裂解液（NONE6960，上海申友生物公司）；染色試劑盒（G1120-100，北京索萊寶科技有限公司）；光學顯微鏡（XTL，美國Nikon公司）；包埋機（BK-TEⅠ，LEICA公司）；烤片機（E0991，Leica公司）；切片機（E0974，Leica公司）；酶標儀（BIOBASE-EL10A，上海閃譜生物科技公司）；蛋白電泳儀（112-0830，美國Bio-Rad公司）；轉膜儀（TY-20101，上海天能科技有限公司）；高速離心機（TG-16W-Ⅰ，Eppendorf公司）；凝膠成像儀（LGDL-96，美國Life Technology公司）

1.2 方法

1.2.1 動物造模模型組和溫陽利水通絡法組小鼠采用尾靜脈注射6.5 mg/kg鹽酸阿霉素建立腎病綜合征模型，小鼠24 h尿蛋白明顯增加即為建模成功，對照組小鼠注射等劑量生理鹽水。造模結束后第5天開始用藥，溫陽利水通絡法組小鼠20 g/（kg·d）灌胃（溫陽利水通絡法共煎制200 g）。根據臨床實際，選擇小鼠與人的等效劑量的倍數為5.98。處方總劑量200 g，如果給體質量60 kg的成人每日服用1劑，即成人劑量3.33 g/（kg·d），則小鼠等效劑量為19.93 g/（kg·d），約為20 g/（kg·d），對照組、模型組小鼠采用同劑量蒸餾水灌胃，1次/d，連續3周。

1.2.2 檢測小鼠腎功能指標取小鼠血、尿樣，檢測肌酐（creatinine，CRE）、尿素氮（blood urea nitro?gen，BUN）及24 h尿蛋白量。

1.2.3 HE染色觀察小鼠腎組織病理變化給藥停止24 h后，小鼠腹腔注射戊巴比妥斷頭處死，取其腎組織，在10%福爾馬林中固定48 h，經過脫蠟、包埋、切片，切片水化后制成玻片標本，加入Mayer's蘇木精在室溫下孵育10 min，加入0.5%曙紅溶液室溫下孵育3 min，鏡下觀察。

1.2.4 腎組織病理評分0分：腎組織各部分正常，沒有腫大及炎癥；1分：腎組織各部分不清晰，出現輕微腫大及炎癥情況；2分：腎組織出現嚴重腫大，炎癥反應明顯；3分：腎組織損傷明顯，邊界不明，炎癥加劇。

1.2.5 小鼠TNF-α、IL-4、IL-8表達血樣離心取上清液，檢測TNF-α、IL-4、IL-8水平。

1.2.6 Western blot檢測小鼠腎組織相關蛋白表達水平腎組織裂解緩沖，測定總蛋白。電泳分離等量蛋白質，4℃下添加一抗孵育過夜，洗滌后添加二抗，顯影后分析蛋白水平。

1.3 統計學分析采用統計學軟件SPSS21.0分析數據，以±s記錄，采用t或F檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腎功能指標模型組小鼠CRE、BUN、24 h尿蛋白量高于對照組；溫陽利水通絡法組CRE、BUN、24 h尿蛋白量低于模型組，見表1。

表1 腎功能指標水平（±s，n=10）Tab.1 Renal function index level（±s，n=10）

表1 腎功能指標水平（±s，n=10）Tab.1 Renal function index level（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P CRE/（mg·dl-1）0.53±0.06 1.49±0.201）0.72±0.092）150.614 0.000 BUN/（mg·dl-1）18.02±2.31 47.06±4.631）24.93±4.022）160.617 0.000 24 h urine protein level/（mg·dl-1）24.02±3.03 79.35±4.711）35.85±3.632）571.416 0.000

2.2 腎組織病理對照組小鼠腎小球，腎小囊清晰可見，無異常（圖1A）；模型組小鼠腎小球形態異常腫大，腎小囊皺縮，基底膜加厚伴系膜基質變多，邊界模糊（圖1B）；溫陽利水通絡法組小鼠腎小球形態改善，腫大減小，腎小囊皺縮緩解（圖1C）。

圖1 腎組織病理變化（×200）Fig.1 Pathological changes of kidney tissue（×200）

2.3 腎組織病理評分模型組小鼠腎組織病理評分增加高于對照組；溫陽利水通絡法組腎組織病理評分低于模型組，見表2。

表2 腎組織病理評分（±s，n=10）Tab.2 Renal histopathological score（±s，n=10）

表2 腎組織病理評分（±s，n=10）Tab.2 Renal histopathological score（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P Renal histopathological score 0.19±0.08 2.66±0.321）0.87±0.212）321.654 0.000

2.4 TNF-α、IL-4、IL-8水平模型組小鼠TNF-α、IL-4、IL-8表達高于對照組；溫陽利水通絡法組TNF-α、IL-4、IL-8表達低于模型組，見表3。

表3 TNF-α、IL-4、IL-8水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of TNF-α，IL-4 and IL-8（±s，n=10）

表3 TNF-α、IL-4、IL-8水平（±s，n=10）Tab.3 Levels of TNF-α，IL-4 and IL-8（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P TNF-α/（ng·ml-1）0.21±0.14 1.35±0.181）0.51±0.122）161.758 0.000 IL-4/（ng·ml-1）0.19±0.08 1.12±0.361）0.38±0.132）48.231 0.000 IL-8/（ng·ml-1）0.32±0.17 1.55±0.311）0.56±0.212）73.779 0.000

2.5 腎組織相關蛋白表達模型組小鼠HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表達高于對照組；溫陽利水通絡法組HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表達低于模型組，見表4、圖2。

圖2 相關蛋白表達Fig.2 Expression of related proteins

表4 相關蛋白表達（±s，n=10）Tab.4 Related protein expression（±s，n=10）

表4 相關蛋白表達（±s，n=10）Tab.4 Related protein expression（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Control Model Wen Yang Li Shui Draining F P HMGB1 0.11±0.05 0.71±0.151）0.34±0.112）75.436 0.000 LC3 0.19±0.11 0.82±0.281）0.40±0.132）28.288 0.000 Beclin-1 0.20±0.09 0.95±0.101）0.47±0.232）60.979 0.000

3 討論

腎病綜合征是表現為蛋白尿、低蛋白血癥、水腫、高脂血癥的腎臟疾病的臨床綜合征，該病的發病原因多種多樣，發病機制也不盡相同，涉及炎癥反應、微循環障礙、代謝異常等多個方面［10-12］。現今的臨床治療以激素類藥物為主，多數患者療效不佳，并且一部分患者長期服用激素類藥物還會產生較大的依賴性，一旦停止服藥，病情就會加劇反彈［13］。腎臟相關的疾病大多與腎間質的損傷密切相關，其中腎臟損害、腎功能減退的主要表現是尿蛋白，同時也是腎病綜合征的顯著表現，并會導致腎小管間質損傷［14］。中醫學將腎病綜合癥歸屬于“水腫”“虛勞”等范疇，其發病機制主要是肺、脾及腎臟功能失調，其本質是腎元虧虛，治療原則當屬疏風行水、運脾化濕、活血化瘀、利濕解毒等［15］。人體的水液代謝與腎、脾、肺的氣化調節密不可分，氣為陽，腎主水，水液代謝與腎陽的盛衰緊密相關，溫陽利水通絡法能夠治療脾腎陽虛型水腫，其臨床療效得到廣泛肯定。研究表明，miR-141與HMGB1/Beclin-1間的平衡是影響腎病綜合征發生發展的重要原因［8］。本文旨在研究溫陽利水通絡法調控HMGB1/Beclin-1信號通路對腎病綜合征的治療效果及作用機制。

自噬這一過程在機體內廣泛進行，自體細胞或細胞部分被吞噬后被攜裹至囊泡中，溶酶體與其結合為自噬溶酶體，滿足細胞自體代謝及更新，保證內環境與細胞代謝互相制衡［16］。相關資料記載，miR-141能夠與HMGB1結合，通過靶向抑制HMGB1的表達截斷HMGB1/Beclin-1信號通路，減輕急性腎損傷誘導產生的腎病綜合征，生理情況下的自噬并不會誘導腎病綜合征的發生發展［15］。但患者體內出現炎癥反應時，外周血中各種類型白細胞的比值會產生變化，嚴重時會導致免疫失衡［17］。相關資料表明，在TNF-α、IL-4、IL-8的調節控制下多個信號通路對炎癥反應起作用［18-19］。本文通過實驗對溫陽利水通絡法、腎病綜合征及HMGB1/Beclin-1信號通路、TNF-α、IL-4、IL-8進行探索。留取小鼠靜脈血以及尿液來檢測小鼠腎功能指標發現，模型組小鼠CRE、BUN、24 h尿蛋白量水平明顯高于對照組，證明造模后小鼠腎功能損傷，通過檢測發現，模型組小鼠TNF-α、IL-4、IL-8水平升高，病理圖也證實模型組小鼠腎組織出現損傷，腎小球腫大，腎小囊皺縮，邊界不清晰，是明顯的炎癥反應，腎組織病理評分也出現異常升高，這提示小鼠模型建立成功，經過溫陽利水通絡法治療后，小鼠腎功能指標水平下降，腎組織炎癥反應得以緩解，腎小球腫脹縮小，腎小囊皺縮減弱，腎組織病理評分下降，TNF-α、IL-4、IL-8也下降，提示溫陽利水通絡法能夠改善小鼠腎功能異常情況，緩解腎組織炎癥反應，可通過調控腎病綜合征大鼠的機體免疫改變，發揮抗炎作用。

Beclin-1是自噬基因［20］。HMGB1與細胞核內轉錄、復制、重組和基因組穩定性等密切相關，對于炎癥、免疫反應、自噬及癌癥也有調節控制作用［21］。相關研究指出，HMGB1可以誘導Beclin-1于Beclin-2中分離，并促進Beclin-1與Ⅲ型磷酸肌醇3激酶結合，激活自噬［22］。miR-141能夠在HMGB1 mRNA的啟動子上結合HMGB1受體從而阻斷其表達，進而抑制HMGB1/Beclin-1通路阻斷激發自噬體過程，但其在腎病綜合征中是否也存在尚不可知［23］。實驗發現，腎病綜合征小鼠造模完成后，小鼠腎組織出現明顯炎癥變化，且蛋白表達上升，表明HMGB1/Beclin-1信號通路與腎病綜合征密切相關，而經過溫陽利水通絡法治療后，小鼠腎組織中HMGB1、LC3、Beclin-1蛋白表達下降，證明溫陽利水通絡法能夠調控HMGB1/Beclin-1信號通路，對于腎病綜合征中腎臟的損傷、炎癥情況及臨床癥狀都具有重要意義。

綜上所述，溫陽利水通絡法能夠調節控制HMGB1/Beclin-1信號通路作用于TNF-α、IL-4、IL-8水平，對于腎臟功能、腎臟損傷、炎癥反應等也具備調節控制作用，同時指出miR-141可能與腎病綜合征關系密切，需進一步深入討論。