IL-6基因多態性與環境因素對原因不明復發性流產的交互影響①

楊麗萍 毛寶宏 劉倩 王燕俠 李靜 代志蓉 李亞梅④

（甘肅省中醫院公共衛生與醫院感染管理處，蘭州730050）

復 發 性 流 產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指在妊娠28周之前有2次以上的胎兒丟失，影響著2%~5%的育齡期女性［1］。RSA在臨床上缺乏特異性且致病原因復雜，主要與遺傳、解剖、內分泌、感染、免疫、環境等因素密切相關，目前仍有50%的RSA患者原因未明［2］。有研究表明，Th1/Th2細胞平衡對母體免疫耐受和妊娠維持至關重要［3］。單核/巨噬細胞產生的促炎細胞因子在脂質代謝、凝血、胰島素抵抗等方面的多功能作用均與原因不明復發性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）有關，而IL-6作為Th2細胞因子，在促進胚胎著床、下調細胞免疫反應以及維持妊娠方面具有重要意義［4］。盡管國內外已有部分研究涉及IL-6基因多態性與URSA的關系，但研究結論尚不一致，且未進行環境-基因交互作用分析［5-6］。因此，本研究采用病例對照的研究方法，探討甘肅蘭州地區育齡期女性IL-6相關基因單核苷酸多態性（single nucleo?tide polymorphism，SNP）及環境危險因素與URSA的遺傳易感性，以期為臨床基因篩查和預防策略的制定提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象以2019年1月至2020年8月在甘肅省婦幼保健院復發性流產門診就診的150例URSA患者為病例組，入選標準：①因胚胎停止發育導致2次及2次以上URSA者；②甲狀腺激素、胰島素、性激素等內分泌檢查正常；③月經周期及排卵正常；④生殖系統解剖結構正常且無細菌、支原體、病毒等感染者；⑤免疫學相關抗體篩查（抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗β2-糖蛋白Ⅰ抗體）正常；⑥丈夫精液分析正常。排除標準：①患有甲狀腺及肝腎功能性疾病者；②凝血功能異常者；③染色體及生殖系統異常者；④其他由遺傳、免疫、感染等因素導致的流產。選取同期在本院體檢的150例健康女性為對照組，入選標準：①至少成功分娩過1胎的育齡期女性；②無RSA及死胎、死產史；③生殖系統解剖結構正常且無遺傳、內分泌異常和感染。

1.1.2 主要試劑與儀器全自動核酸純化儀HF16 Plus［愷碩生物科技（廈門）有限公司］；2720型PCR擴增儀（ABI）；蝦堿酶（Promega）；外切酶Ⅰ（Epicentre）；SNaPshot Multiplex Kit（ABI）；FR-110紫外分析儀、FR-250電泳儀（上海復日科技有限公司）；凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基線調查方法經甘肅省婦幼保健院倫理委員會批準后，研究對象在自愿參與的基礎上，由統一培訓的專職醫務人員以面對面詢問的形式現場填寫調查表，獲取一般人口學特征、生理生育史、環境暴露史及相關生活行為特征。同時采集每位研究對象外周血3 ml，于2 h內入庫深低溫（-80℃）儲存。

1.2.2 DNA提取①在2.0 ml樣品管內加入40μl蛋白酶K溶液（10 mg/ml），再加入400μl解凍后的全血樣本進行預處理；②嚴格按照相關操作步驟，利用全自動核酸純化儀HF16 Plus及其配套試劑盒進行全自動DNA提取；③使用分光光度計檢測提取DNA濃 度 和 純 度，DNA濃 度>20 ng/μl表 明 提 取成功。

1.2.3 基因分型本研究采用SNaPshot多重SNP分型技術對rs1800796位點進行基因分型檢測。SNaPshot多重SNP分型技術由美國應用生物公司（ABI）開發的一種基于熒光標記單堿基延伸原理的分型技術，也稱小測序，主要用于中等通量的SNP分型，其優勢為分型準確、通量高、檢測速度快，且不受樣本個數與SNP位點多態性特性限制。引物用在線Primer3軟件設計（http：//bioinfo.ut.ee/prim?er3-0.4.0/），引物序列及長度見表1。具體基因分型過程如下：①PCR擴增：在PCR擴增儀上進行擴增，程序如下：95℃2 min；94℃20 s，65℃（-0.5℃/循環）40 s，72℃1.5 min，11個循環；94℃20 s，59℃30 s，72℃2 min，24個循環；72℃2 min。將5 U蝦堿酶和2 U外切酶Ⅰ加入10μl PCR產物中，37℃溫浴1 h，然后75℃滅活15 min進行純化。②SNaPshot多重單堿基延伸反應：延伸反應體系（10μl）包括5μl SNaPshot Multiplex Kit（ABI），2μl純化后多重PCR產物，1μl延伸引物混合物，2μl超純水。程序如下：96℃1 min；96℃10 s，55℃5 s，60℃30 s，28個循環。然后在10μl延伸產物中加入1 U SAP酶，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min進行純化。③測序檢測：取0.5μl純化后的延伸產物，與0.5μl Liz120 SIZE STANDARD、9μl Hi-Di混勻，95℃變性5 min后用ABI3730XL測序儀進行測序，測序儀上收集的原始數據用GeneMapper 4.1軟件進行分析。

表1 擴增的SNP引物序列Tab.1 Primer sequence of amplified SNP

1.3 統計學分析以SAS9.4軟件建立數據庫進行統計分析。采用χ2檢驗完成組間一般特征分布及Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。利用非條件Logis?tics回歸模型分析IL-6基因SNP位點及環境因素與URSA的關系。基于叉生分析法用相乘交互作用模型探討環境-基因交互作用對URSA的影響。檢驗水準α取值0.05。

2 結果

2.1 一般情況本研究共納入研究對象300例，其中URSA組150例，對照組150例。經均衡性檢驗，兩組在年齡、文化程度、家庭人均月收入、居住地、工作類別等方面差異有統計學意義（P<0.05），URSA人群文化程度與家庭人均月收入普遍較低，以農村人口居多，且多數從事中度以上體力勞動，詳見表2。

表2 研究對象一般特征分布［例（%）］Tab.2 Distribution of basic characteristics of study population［n（%）］

2.2 IL-6基因rs1800796位點基因多態性與URSA易感性的關聯經檢驗，兩組人群IL-6基因rs1800796位點基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P<0.05）。在共顯性模型中，與CC基因型相比，攜帶GC基因型女性發生URSA的風險增加1.91倍（OR=1.91，95%CI：1.09~3.36），攜帶GG基因型女性發生URSA的風險增加1.54倍（OR=1.54，95%CI：1.02~2.34）。顯性遺傳模型分析顯示，與未攜帶G等位基因女性相比，攜帶G等位基因發生URSA的風險增加2.03倍（OR=2.03，95%CI：1.18~3.47）。隱性遺傳模型分析顯示，組間基因型分布差異無統計學意義。按流產次數進一步進行分層分析，結果顯示在共顯性遺傳模型、顯性遺傳模型及隱性遺傳模型中，G等位基因攜帶者均不增加2次RSA的發病風險（OR=1.44，95%CI：0.92~2.26；OR=2.05，95%CI：0.95~3.47；OR=1.49，95%CI：0.68~3.26），但顯著增加3次以上RSA的發生風險（OR=2.46，95%CI：1.17~5.13；OR=2.15，95%CI：1.17~3.61；OR=2.15，95%CI：1.10~8.97），見表3。

表3 rs1800796位點SNP與URSA易感性的關系Tab.3 Association between rs1800796 SNP and risk of URSA

2.3 IL-6基因rs1800796位點基因多態性與URSA易感性的分層分析分別以年齡、工作屬性、吸煙（包括主動和被動）、環境高危因素進行分層分析，結果顯示在高齡、重體力勞動、吸煙（包括主動和被動）、接觸環境高危因素女性中，G等位基因攜帶者發生URSA的風險分別增加3.96倍（OR=3.96，95%CI：1.17~12.47）、4.98倍（OR=4.98，95%CI：1.38~15.98）、1.86倍（OR=1.86，95%CI：1.19~2.92）與1.89倍（OR=1.89，95%CI：1.28~2.77）。同樣，顯性及隱性遺傳模型分析中，得到類似的研究結果，見表4。

表4 rs1800796位點SNP與環境相關因素對URSA易感性的分層分析Tab.4 Stratified analysis on association between rs1800796 SNP and environmental risk factors and risk of URSA

2.4 IL-6基因rs1800796位點基因多態性與環境因素的交互作用分析叉生分析顯示，吸煙（包括主動和被動）、接觸環境高危因素且攜帶GC+GG基因型女性并未增加URSA的發生風險（OR=1.29，95%CI：0.98~1.69；OR=1.23，95%CI：0.99~2.98），但進一步代入相乘交互作用模型分析顯示，吸煙（包括主動和被動）且攜帶GC+GG基因型女性發生URSA的風險增加1.96倍（OR=1.96，95%CI：1.15~3.35）。接觸環境高危因素且攜帶GC+GG基因型女性 發 生URSA的 風 險 增 加2.18倍（OR=2.18，95%CI：1.29~3.68）。同理，從事重體力勞動且攜帶GC+GG基因型女性發生URSA的風險增加3.27倍（OR=3.27，95%CI：1.98~5.40），見表5。

表5 rs1800796位點SNP與部分環境因素的交互作用Tab.5 Analysis of interaction between environmental factors and rs1800796 SNP on risk of URSA

3 討論

URSA病因復雜，其發病機制至今尚未完全明確，是目前生殖健康領域面臨的重點與難點問題，嚴重影響著我國育齡期女性的生殖健康。母胎界面存在獨特的細胞因子網絡，各因子之間的平衡及免疫調節對維持正常妊娠至關重要。有研究顯示，一定程度的炎癥反應能促進維持正常妊娠，但過度炎癥反應又可導致胚胎著床失敗，引起URSA的發生，故母胎界面的免疫失衡在URSA的發生發展過程中發揮了重要作用［7-9］。

人類IL-6基因位于染色體7p15~21區域，由4個內含子和5個外顯子組成。IL-6是白介素家族中的一種多肽類促炎細胞因子，是機體復雜細胞因子調節網絡中的關鍵成員，主要在急性炎癥反應、免疫反應及C反應蛋白急性期的蛋白調控等方面發揮重要作用，是一類調節Th17/Treg平衡的重要細胞因子［10-11］。有研究表明，URSA患者外周血中IL-6細胞因子水平與健康人群間存在顯著性差異，并指出IL-6基因rs1800796位點基因多態性可能增加了URSA的發生風險，但其結論尚不一致［5-6，12-13］。本研究顯示，IL-6基因rs1800796位點攜帶G等位基因的育齡期女性發生URSA的風險增加2.03倍，發生3次以上URSA的風險增加2.15倍。也有研究表明，IL-6基因參與蛻膜調節性T（Treg）細胞中STAT3的磷酸化過程，而STAT3過度磷酸化會損害細胞的增殖，抑制Treg細胞分泌細胞因子，影響母胎免疫耐受及胚胎植入，這可能是發生URSA的病理基礎［8］。

環境是人類生存和發展的物質基礎，在人類長期的進化過程中，已逐漸對生態環境的變化做出了適應和改造，形成一種動態的過程平衡，而一旦這種平衡被打破將導致URSA等不良妊娠結局的發生［14］。有研究顯示，工作或生活環境中接觸過量苯、甲苯、甲醛等空氣污染物會引起胚胎毒性導致流產［15］；接觸環境鉛、砷、汞等重金屬化合物可干擾正常妊娠的內分泌狀態，導致胚胎丟失［16］；接觸殺蟲劑、化肥、增塑劑等合成化學品后改變體內氧化應激與免疫平衡狀態，引發自然流產。本研究顯示，G等位基因攜帶者中，接觸環境高危因素的育齡女性發生URSA的風險增加1.89倍；吸煙（包括主動和被動）女性發生URSA的風險增加1.86倍。進一步進行環境-基因交互作用分析顯示，接觸環境高危因素且攜帶GC+GG基因型育齡女性發生URSA的風險增加2.18倍；從事重體力勞動且攜帶GC+GG基因型女性發生URSA的風險增加3.27倍。說明環境高危因素及重體力勞動分別與rs1800796位點基因多態性存在正向協同的交互作用，提示URSA病因復雜，環境與遺傳因素在其發生發展過程中均發揮了非常重要的作用。

總之，IL-6基因表達產物在孕早期胚胎植入與胎盤發育過程中發揮了重要作用，其rs1800796位點的基因突變可能會改變母胎界面相關細胞因子的表達水平，破壞調控平衡，造成妊娠丟失［17］，但它們如何影響和調節相關趨化因子的表達，還需要進一步的探究。另外，環境-基因交互作用分析顯示，孕早期接觸環境高危因素、吸煙（包括主動和被動吸煙）、重體力勞動均與IL-6基因rs1800796位點基因突變存在相乘的交互作用。說明URSA是由環境和遺傳因素共同影響的復雜性疾病，在今后的研究中應進一步結合環境因素-內表型-基因進行交互分析，這將有助于從更廣泛的角度去闡明URSA的病理機制。