宮頸癌患者中VEGF、OLFM4、miR-124表達水平及聯合對復發預測價值分析

李惠彬，趙清平，余夢虹，錢 瑩*，王 剛

(1.四川省崇州市婦幼保健院婦科，四川 崇州 611230；2.四川省婦幼保健院婦科，四川 成都 610000)

宮頸癌(cervical cancer，CC)是婦科常見的惡性腫瘤，其發病率高居女性惡性腫瘤第3位，僅次于乳腺癌及結直腸癌，已成為嚴重威脅女性健康的全球性問題[1]。近年我國CC的發生率逐漸增高，且呈現年輕化趨勢，加強防治非常重要[2]。研究顯示，CC的發生需要經過漫長的宮頸癌前病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)階段，因此CIN階段的檢查和治療是預防CC發生的關鍵環節[3-4]。有證據表明，血管內皮生長因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)是促腫瘤血管產生的主要因子，其表達增加可促進腫瘤細胞增殖作用，在多種惡性腫瘤組織中呈高水平表達[5]。嗅覺介導素4(olfactomedin，OLFM4)是一種糖蛋白，可促進腫瘤細胞生長和發展轉移，在CIN早期診斷方面具有良好應用價值[6]，但在CC中的研究較少。此外，微小RNA-124(microRNA-124，miR-124)是與腫瘤發生發展密切相關的小分子核糖核酸，有報道指出miR-124具有抑制CC細胞增殖及遷移的能力[7]。基于此，本研究嘗試探討VEGF、OLFM4、miR-124檢測在CC、CIN中的表達情況及臨床意義，旨在為臨床防治CC提供參考。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2015年10月—2018年10月于我院行手術治療的CC患者82例為CC組，同期CIN患者82例為CIN組，正常宮頸組織標本82例為正常組。CC組年齡31～72歲，平均(52.16±9.91)歲；體重指數19.2～27.3，平均23.21±2.00；絕經情況為絕經45例，未絕經37例；合并癥為高血壓15例，糖尿病12例，高脂血癥8例。CIN組年齡28～73歲，平均(50.83±11.08)歲；體重指數19.0～27.1，平均23.14±1.97；絕經情況為絕經42例，未絕經40例；合并癥為高血壓12例，糖尿病17例，高脂血癥11例。正常組年齡26～70歲，平均(49.91±10.04)歲；體重指數18.8～26.7，平均22.87±1.91；絕經情況為絕經38例，未絕經44例；合并癥為高血壓17例，糖尿病10例，高脂血癥6例。3組年齡、體重指數、絕經情況、合并癥比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究經醫院倫理委員會審批通過。所有患者及其家屬均知情同意且簽署知情同意書。

1.2納入標準與排除標準 納入標準：①CC標本、CIN標本、正常宮頸組織標本均經病理診斷確診；標本均來自于子宮切除后宮頸標本；②患者宮頸完整，既往無宮頸手術或物理治療史；③患者臨床資料完整，能滿足本研究需求。排除標準：①合并其他惡性腫瘤者；②CC復發患者；③嚴重感染、臟器功能不全者；④合并其他惡性腫瘤者。

1.3方法 各組組織標本取得后即刻置于10%甲醛溶液中固定過夜，取組織標本，常規進行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制片(4 μm)，采用羅氏公司生產的CINtec PLUS型全自動免疫組化分析儀，以免疫組織化學法測定各標本中VEGF、OLFM4陽性表達率，染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，采用BX51光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)下觀察，每個切片隨機選取5～10個高倍視野，每個視野計數100個瘤細胞，著色細胞<10%或無著色細胞為陰性(-)，著色細胞百分比≥10%為陽性(+)。取組織標本，采用實時熒光聚合酶鏈式反應檢測miR-124水平，采用Trizol法提取總RNA，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，采用美國Promega公司生產的逆轉錄試劑盒購將RNA反轉錄為cDNA，參照SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司)說明書設計反應體系和反應條件，進行熒光聚合酶鏈式反應，miR-124正向引物為5′-GCTAAGGCACGCGGTG-3′，反向引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。內參基因為U6，U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物為5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。應用公式2-△△ct計算miR-124相對表達水平。

1.4觀察指標 ①3組組織標本中VEGF、OLFM4、miR-124表達情況。②CC組不同病理參數(年齡、體重指數、臨床分期、分化程度、腫瘤直徑)患者組織標本中VEGF、OLFM4、miR-124表達陽性率，分析組織標本中各指標表達與CC組病理參數的關系。③CC組通過門診或電話隨訪3年，統計3年內復發情況，比較3年復發與未復發患者組織標本中VEGF、OLFM4、miR-124表達情況。④分析VEGF、OLFM4、miR-124聯合檢測對復發預測價值。

1.5統計學方法 應用SPSS22.0統計軟件分析數據。計數資料比較采用χ2檢驗；計量資料比較采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗；采用Spearman相關系數模型分析相關性，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13組組織標本中VEGF、OLFM4、miR-124表達 VEGF、OLFM4在CC組組織標本中陽性表達率均較CIN組和正常組高，miR-124在CC組組織標本中表達水平均較CIN組、正常組低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組組織標本中VEGF、OLFM4、miR-124表達比較

2.2CC組不同病理參數患者組織標本中VEGF、OLFM4、miR-124表達陽性率 CC組miR-124表達情況以、miR-124均值為界限，>均值判定為陽性，<均值判定為陰性。不同年齡、體重指數CC患者組織標本中VEGF、OLFM4、miR-124表達陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，且不同腫瘤直徑CC患者組織標本中OLFM4、miR-124表達陽性率差異無統計學意義(P>0.05)；有臨床分期Ⅱ期、低分化患者組織標本中VEGF、OLFM4表達陽性率均高于臨床分期Ⅰ期、高中分化患者，差異有統計學意義(P<0.05)，且腫瘤直徑>4 cm患者組織標本中VEGF表達陽性率高于腫瘤直徑≤4 cm患者，有臨床分期Ⅱ期、低分化患者組織標本中miR-124表達陽性率均低于臨床分期Ⅰ期、高中分化患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 CC組不同病理參數患者組織標本中VEGF、OLFM4、miR-124表達陽性率比較

2.3組織標本中各指標表達與CC組病理參數的關系 Spearman相關分析可知，CC組VEGF、OLFM4、miR-124表達陽性率與年齡、體重之間無明顯相關性，且腫瘤直徑與OLFM4、miR-124表達陽性率無明顯相關性(P>0.05)；CC組VEGF、OLFM4表達陽性率與分化程度呈負相關，與臨床分期呈正相關，且組織標本中VEGF表達陽性率與腫瘤直徑呈正相關(P<0.05)，組織標本中miR-124表達陽性率與分化程度呈正相關，與臨床分期呈負相關(P<0.05)。見表3。

表3 組織標本中各指標表達與CC組病理參數的關系

2.4不同預后CC患者組織標本中各指標表達陽性率 3年復發患者組織標本中VEGF、OLFM4表達陽性率高于未復發患者，miR-124表達陽性率低于未復發患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同預后CC患者組織標本中各指標表達陽性率

2.5復發預測價值分析 VEGF、OLFM4、miR-124對復發的預測AUC分別為0.820、0.895、0.852，聯合預測AUC為0.945，明顯高于單一預測AUC。見圖1。

圖1 復發預測價值ROC曲線

3 討 論

CC是目前唯一病因明確的婦科惡性腫瘤，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是引發CC的主要原因，其中90%以上為高危型HPV感染所致[8]。CC患者生物機制、病理類型等與其預后聯系密切，因此加強與CC發生發展相關機制的研究，有助于疾病早期診治。

VEGF是促進人體新生血管形成、增加血管通透性的重要糖蛋白，作為目前已知在腫瘤血管生成中作用最強的中介因子，其可經旁分泌作用于血管內皮細胞，促血管內皮細胞增殖、遷徙，從而加速新血管生成，增加腫瘤細胞周圍血運，為腫瘤轉移提供有利基礎[9-10]。國內蘇文芳[11]研究顯示，CC組織標本中VEGF陽性表達率明顯高于癌旁正常組織。Fu等[12]報道指出CC組織中VEGF的表達明顯上調。本研究顯示，CC組織標本中VEGF陽性表達率明顯高于正常宮頸組織標本，與上述報道結果一致，且本研究進一步分析了CC與CIN組織標本中VEGF的表達差異，結果顯示CC組織標本中VEGF陽性表達率明顯升高，而CIN標本與正常宮頸組織標本中VEGF陽性差異無統計學意義，說明VEGF的表達升高可促進CC的發生，其作用可能是在CC早期體現，而在CIN階段體現不明顯，據此推測VEGF檢測可用于CC早期診斷中。本研究還顯示CC組織標本中OLFM4陽性表達率明顯高于CIN及正常宮頸組織標本，且CIN組織標本中高于正常宮頸組織標本，說明OLFM4在CIN階段即可能已經參與CC的發生發展。OLFM4屬糖蛋白，具有抗細胞凋亡作用，OLFM4高水平表達可作用于S期、G2/M期DNA合成，加速細胞周期進程，促使腫瘤細胞增殖，同時能通過調節PI3K/PKB信號通路促腫瘤細胞生長，還能與細胞外黏附分子相互作用，參與腫瘤細胞的轉移[13]。但既往有報道指出OLFM4在CIN2組織中的陽性表達率為94.0%，與在CC組織中的96.8%接近[14]，與本研究結果存在一定差異，這可能與CIN組織標本的選取不同有關，仍需通過大樣本研究進一步驗證。

此外，近年miRNA在惡性腫瘤發生進展中越來越受臨床重視，miR-124屬于miRNA的一種，有證據顯示其在CC組織中的表達降低，能加速癌癥病變，且與癌細胞過度增殖、凋亡不足、侵襲性生長密切相關[15]。本研究顯示，CC組織標本中miR-124表達水平均低于CIN及正常宮頸組織標本，說明miR-124在CC組織中的表達明顯降低，與上述報道結果一致。miR-124被證實是一種抑癌基因，具有抑制癌細胞增殖、遷移的功能[16]，其表達降低導致對CC細胞增殖及遷移的抑制作用減弱，最終引起CC。有報道認為miR-124抑癌作用可能與調節上皮-間充質轉化活性有關，且能調節TRAF6等參與腫瘤的發生發展[17-18]。在以上研究結果基礎上，本研究進一步分析了CC患者組織標本中VEGF、OLFM4及miR-124表達情況與患者病理參數的相關性，結果顯示VEGF、OLFM4表達升高、miR-124表達降低與CC患者癌細胞增殖密切相關，且對預后復發具有一定的預測價值，且聯合價值更高。

綜上可知，CC患者癌組織中VEGF、OLFM4及miR-124表達情況與CC生物學行為密切相關，聯合檢測可有效預測腫瘤術后復發。但本研究仍存在一定不足，如未探究CC患者癌組織中VEGF、OLFM4、miR-124表達之間的關系，未能明確三者在CC發生發展中是否存在協同關系，未來工作中仍需深入探討。