484例疑似ABO新生兒溶血病患兒的血清學實驗結果及相關影響因素分析

陳文雅(通信作者)，王明泉，高晶晶

泉州市第一醫院輸血科 (福建泉州 362000)

新生兒溶血病(hemolytic disease of the newborn，HDN)特指由于母嬰之間的血型不合所引發的胎兒或新生兒紅細胞遭受破壞的一種免疫性溶血性疾病[1]，其主要臨床癥狀及體征為不同程度的黃疸、水腫、貧血、肝脾腫大，嚴重者可繼發膽紅素腦病，即核黃疸。核黃疸的病死率達70%，即便患兒存活下來，也會遺留運動障礙、智力不全等后遺癥[2]。在過去幾十年中，得益于抗-D免疫球蛋白在RhD新生兒溶血病(RhD-HDN)免疫預防中的成功應用，因RhD引發的妊娠期異體免疫發生率得到大幅度下降，HDN的模式也發生了轉變，ABO血型系統不合及其他非D型同種異型抗體已成為許多發達國家發生HDN的最主要原因[3]。中國作為發展中國家，以ABO血型系統不合(約占85.3%)最為常見，其次為Rh血型系統不合(約占14.6%)[4]。眾所周知，ABO新生兒溶血病(ABO-HDN)的臨床癥狀較輕，絕大多數患兒僅表現為黃疸，少數患兒可出現貧血、水腫等癥狀[5]；但也有文獻[6-7]報道過因ABO-HDN引發較為嚴重的溶血病病例，部分患兒需采取換血治療，這也提醒我們，ABO-HDN并不總是輕癥，也需臨床多給予關注與重視。本研究通過分析我院收治的484例疑似ABO-HDN患兒的血型血清學實驗結果及臨床病歷資料，旨在了解ABO-HDN的發生分布情況，探討該病的相關影響因素，以期為ABO-HDN的早期診斷提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2021年11月在我院順利分娩的484對符合條件的母嬰為研究對象。母親年齡17～46歲，平均(30.04±4.60)歲；患兒進行溶血三項檢測時的日齡為10 h至36 d，平均(4.91±4.85)d；出生體質量1 800～4 250 g，平均(3 190.46±438.49)g；其中，男患兒246例，女患兒238例。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

納入標準：母嬰ABO血型不合；母嬰RhD均為陽性；母親血型不規則抗體篩查結果呈陰性；母嬰雙方病歷資料均完整；單胎妊娠。排除標準：孕婦既往有輸血史；孕婦有自身免疫性溶血性疾病或其他溶血性疾病；新生兒患有除ABO-HDN之外的其他溶血性疾病。

1.2 儀器與試劑

所使用的儀器與試劑包括全自動血型/配血系統分析儀、卡式離心機、ABO-Rh血型檢測卡、抗人球蛋白檢測卡、人ABO血型反定型用紅細胞測定試劑盒、紅細胞血型抗體篩選細胞，均由Diagnostic Grifols,S.A.配套提供；FYQ型試劑卡孵育器由長春博研科學儀器有限責任公司提供，Baso微電腦控制血庫專用離心機由臺灣貝索生物技術有限公司提供，酸放散試劑盒由長春博迅生物技術有限責任公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1血型與不規則抗體篩查的檢測

ABO血型、Rh(D)血型及血型不規則抗體篩查均由Diana全自動血型/配血系統分析儀進行全自動化檢測。

1.3.2溶血三項檢測

(1)直接抗人球蛋白試驗：向抗人球蛋白檢測卡反應孔內加入50 μl患兒的紅細胞懸液(濃度為1%)，離心(1 100 r/min)處理9 min后判讀結果。(2)游離抗體試驗：向已標記好的抗人球蛋白檢測卡各反應孔內加入50 μl血型抗體篩選紅細胞試劑、ABO血型反定型用紅細胞試劑，再向各反應孔內加入25 μl患兒血清，以37 ℃孵育15 min，離心(1 100 r/min)處理9 min后判讀結果。(3)抗體放散試驗：使用0.9%氯化鈉注射液洗滌患兒紅細胞3遍，最后1遍的洗滌液留取作為對照；嚴格按照酸放散試劑盒的使用說明書操作制備放散液，向已標記好的抗人球蛋白檢測卡各反應孔內加入50 μl血型抗體篩選紅細胞試劑、ABO血型反定型用紅細胞試劑，再向各反應孔內加入25 μl上述制備好的放散液和對照液，以37 ℃孵育15 min，最后離心(1 100 r/min)處理9 min后判讀結果。

1.4 ABO-HDN診斷標準[8]

(1)母嬰之間存在ABO血型不合。(2)抗體放散試驗為診斷ABO-HDN的金標準，只要抗體放散試驗為陽性，即可診斷為ABO-HDN；抗體放散試驗為陰性，而直接抗人球蛋白試驗和(或)游離抗體試驗為陽性，則為可疑ABO-HDN；三項檢測結果均為陰性，則不可診斷為ABO-HDN。

1.5 統計學處理

使用Excel 2016建立數據庫，使用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，樣本率間的比較采用χ2檢驗，單向有序R×2表資料的研究目的若為分析樣本率與等級分層變量之間是否存在線性變化趨勢，則采用線性趨勢卡方檢驗；多因素分析采用Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 484份溶血三項檢測結果

484份疑似ABO-HDN患兒的標本，共檢測出陽性標本321份，其中，305例被確診為ABO-HDN，其余16例被判定為可疑ABO-HDN；321份陽性標本中，主要檢出組合為三項試驗均陽性、游離抗體試驗和抗體放散試驗雙陽性及抗體放散試驗單陽性，占87.54%(281/321)；305例確診患兒中，直接抗人球蛋白試驗檢出127例(占41.64%)，游離抗體試驗檢出218例(占71.48%)，抗體放散試驗檢出305例(占100%)，見表1。

表1 484份溶血三項檢測結果分布情況

2.2 不同母嬰ABO血型不合組合的ABO-HDN陽性率情況

母親為O型的患兒(O-A、O-B)ABO-HDN陽性率為72.88%(301/413)，母親為非O型的患兒(A-AB、A-B、B-A、B-AB)ABO-HDN陽性率為5.63%(4/71),差異有統計學意義(χ2=117.558，P<0.05)；母親為O型、患兒為A型或B型的ABO-HDN陽性率分別為59.88%、81.27%，差異有統計學意義(χ2=22.809，P<0.05)，見表2。

表2 不同母嬰ABO血型不合組合的ABO-HDN發生分布情況

2.3 送檢日齡對ABO-HDN檢出率的影響

不同送檢日齡的ABO-HDN檢出率不完全相同(χ2=61.343，P<0.05)；而且，經線性趨勢卡方檢驗顯示，隨著送檢日齡的推遲，ABO-HDN檢出率呈線性下降趨勢(χ2=59.249，P<0.05)，見表3。

表3 不同送檢日齡分組的ABO-HDN檢出分布情況

2.4 患兒發生ABO-HDN的單因素分析

經單因素分析顯示，ABO-HDN的發生可能受母親妊娠次數、患兒性別及出生體質量的影響(P<0.05)；不受母親年齡的影響(P>0.05)，見表4。

表4 患兒發生ABO-HDN的單因素分析[例(%)]

2.5 患兒發生ABO-HDN的多因素分析

以單因素分析中具有統計學意義的影響因素為自變量進行賦值(見表5)，通過二項Logistic回歸分析顯示，母親妊娠次數≥2次、女患兒、出生體質量≥3 000 g是ABO-HDN發生的獨立危險因素(P<0.05)，見表6。

表5 自變量賦值情況

表6 患兒發生ABO-HDN的多因素分析

3 討論

ABO-HDN的發生源于胎兒從父方遺傳到母方所缺乏的A型或B型抗原，導致母嬰ABO血型不合，一旦胎兒的紅細胞通過胎盤進入到母體中，即有可能對母體形成免疫刺激，產生相應的IgG抗體；IgG抗體作為唯一能通過胎盤的抗體類型，再借助胎盤反向進入胎兒體內，致敏胎兒紅細胞，并激活單核-巨噬細胞系統，釋放大量溶酶體酶，破壞胎兒紅細胞，最后造成溶血[9]。ABO-HDN在胎兒時期溶血所產生的多余膽紅素可經胎盤由母體代為清除，出生后溶血仍在繼續，但新生兒相對不成熟的肝臟系統無法清除過量的膽紅素，因而造成新生兒高膽紅素血癥，而皮膚黃染等征象一般于新生兒出生后2～3 d才逐漸顯現[10-11]。鑒于ABO-HDN的臨床表現相對滯后于其真實病情，為了避免因延遲診斷和治療給患兒健康造成損害，提升ABO-HDN的早期診斷能力尤為重要。

溶血三項檢測是目前國內診斷ABO-HDN最主要的血清學實驗。本研究結果顯示，溶血三項檢測結果顯示，484例疑似ABO-HDN患兒中，305例被確診為ABO-HDN，確診率達63.02%(305/484)，與尹明偉等[12]報道的69.97%確診率相近。主要陽性檢出模式集中分布于三項試驗均陽型、游離抗體試驗和抗體放散試驗雙陽性及抗體放散試驗單陽性這三種組合，占87.54%。在305例確診病例中，直接抗人球蛋白試驗檢出127例(占41.64%)，游離抗體試驗檢出218例(占71.48%)，抗體放散試驗檢出305例(占100%)。可見，抗體放散試驗的靈敏度最高，直接抗人球蛋白試驗的靈敏度最低。直接抗人球蛋白試驗與抗體放散試驗均為檢測患兒紅細胞是否被IgG抗體致敏的試驗，但由于在新生兒時期，機體ABO抗原表達量僅為成人的25%～50%，導致可結合于患兒紅細胞上的IgG抗體相對有限，因此易造成直接抗人球蛋白試驗出現假陰性的結果[13]；抗體放散試驗則相當于直接抗人球蛋白試驗的放大試驗，利用比直接抗人球蛋白試驗多出幾百倍紅細胞的量，通過酸放散等方法將致敏于紅細胞上的IgG抗體洗脫下來，因而獲得含有高滴度IgG抗體的放散液，從而提升了試驗的靈敏度[14]。當然，有關ABO-HDN的診斷不能單純依靠溶血三項檢測，還需完善其他相關輔助性檢查，并結合患兒臨床表現進行綜合分析。有文獻指出[15]，網織紅計數、臍帶血總膽素或早期總膽紅素(產后第6小時)及產前母體IgG抗-A(B)滴度等有助于ABO-HDN的早期診斷。由于本研究為回顧性調查，在資料收集上有一定的局限性，故可出現部分檢查缺失、檢測時間不統一或檢測方法不一致等情況，導致未能綜合分析其他輔助檢查與溶血三項檢測相結合對ABO-HDN早期診斷的臨床應用價值。

通過對母親是否為O型的患兒進行分組比較后我們發現，母親為O型的ABO-HDN陽性率高達72.88%，母親為非O型的ABO-HDN陽性率僅為5.63%，差異有統計學意義(P<0.05)。該結果說明，ABO-HDN高發于O型產婦所分娩的非O型新生兒；母嬰血型為O-A、O-B的患兒ABO-HDN陽性率分別為59.88%、81.27%，顯然，B型患兒的陽性率高于A型患兒，差異有統計學意義(P<0.05)，該結果與Bel Hadj等[16]和陳陸飛等[17]的研究結果相一致，但與楊愛月等[18]和李彥美等[19]的研究結果不一致。有關A型、B型患兒ABO-HDN陽性率的比較，不同的研究得出的結果截然不同，筆者分析其原因可能與不同地區ABO血型的分布存在差異有關。

本研究結果顯示，當送檢日齡為0～2 d時，ABO-HDN檢出率高達82.66%；但隨著送檢日齡的推遲，ABO-HDN檢出率呈逐步下降的趨勢。這主要考慮隨著產婦病情進展，被致敏患兒的紅細胞不斷被機體識別破壞，游離于血漿中的IgG抗體也不斷被機體中的血型抗原物質所中和消耗，從而導致檢出率逐步下降[20]。這也提示我們，應盡快對可疑ABO-HDN患兒進行溶血三項檢測，以免因假陰性結果而延誤治療；同時我們發現，當送檢日齡≥7 d時，仍有32.39%的檢出率，提示日齡超7 d的患兒依然有進行檢測的意義，但也需警惕，其存在假陰性率較高的風險。需要注意的是，送檢日齡在一定程度上也受臨床醫師對疾病風險評估的影響，越是早期送檢，面臨的臨床預估風險往往越大，這也可能是早期送檢檢出率偏高的原因之一。基于日齡對ABO-HDN檢出率的影響，筆者提議，留取新生兒臍帶血樣本進行血型鑒定和溶血三項檢測等檢測，不僅有助于ABO-HDN的早期診斷，而且可減少有創操作對患兒造成的損傷。早在2015年，意大利1份有關預防和治療HDN的建議書中就曾提出，對所有新生兒臍帶血樣本進行直接抗人球蛋白試驗檢測，若試驗呈陽性，再進行抗體放散試驗檢測[21]。結合我國國情，對所有新生兒進行普遍篩查顯然是不切實際的，但可通過制定ABO-HDN風險評估標準，針對達到中高風險的新生兒進行常規篩查。

兩項Logistic回歸分析顯示，母親妊娠次數≥2次、女患兒、出生體質量≥3 000 g是ABO-HDN發生的獨立危險因素(P<0.05)。由于自然界廣泛存在與A、B型抗原相類似的物質(如植物、寄生蟲、細菌、傷寒疫苗、破傷風及白喉類毒素等)，若母親在首次妊娠前接觸到這類物質，即有可能免疫刺激母體，產生IgG抗-A(B)抗體，因此，ABO-HDN可發生于第一胎[22]，且伴隨著母親妊娠次數的增加，胎兒紅細胞再次進入母體的概率也隨之增加；與初次免疫應答不同的是，再次免疫應答只要接觸到小劑量的抗原，便可快速產生大量且持續時間較長的IgG抗體，誘發ABO-HDN發生，因此，妊娠史可增加ABO-HDN的發生風險[23]。有關出生體質量對ABO-HDN發生的影響，考慮可能為出生體質量≥3 000 g的患兒ABO血型抗原發育相對于出生體質量<3 000 g的患兒成熟，這更有利于IgG抗-A(B)抗體致敏于紅細胞上，故而增加了發病風險[24]；至于女患兒更易發生ABO-HDN，考慮其原因可能與患兒雌激素水平有關；據文獻報道[25]，雌激素有增強免疫反應的作用。

綜上所述，溶血三項檢測對ABO-HDN的診斷具有重要價值；其中，抗體放散試驗具有高靈敏度的特征。鑒于送檢日齡對ABO-HDN檢出率的影響，針對可疑ABO-HDN的患兒，應盡早進行溶血三項檢測，以免因漏診而延誤治療；同時，筆者也提倡，應合理完善產前關于ABO-HDN的輔助性檢查，如夫婦血型鑒定、母體IgG抗-A(B)滴度及IgG亞型測定、母體外周血游離胎兒DNA(cff-DNA)血型基因檢測、胎兒大腦中動脈峰值流速(MCA-PSV)多普勒檢測等，綜合考量產前檢測及相關危險因素的影響，制定ABO-HDN風險評估標準[26, 27]。對達到中高風險的新生兒，應留取臍帶血樣進行血型鑒定、溶血三項檢測、網織紅計數和總膽紅素測定，以實現早診斷早治療，保障患兒生命健康。