黃芩苷對創傷性腦損傷模型大鼠的治療作用及Akt/Nrf2 信號通路的影響

陳 健 潘 達 金 燦 聞 浩 孟偉陽 葉孫志

創傷性腦損傷（TBI）是人類死亡和致殘的主要原因之一。腦損傷可分為原發性和繼發性兩個階段，原發性損傷是腦組織的機械性破壞，而繼發性損傷則在較長時間內發展，包括氧化應激和炎癥反應，最終導致神經元細胞死亡[1]。目前臨床上對TBI 主要通過補液、降低顱內壓、開顱手術等方式進行治療[2]。但是TBI 發生后所引起的一系列炎癥反應在疾病的繼發性損傷中起到了重要作用，因此找到其作用機制，對于TBI 后繼發損傷發生的預防具有重要意義。蛋白激酶B（Akt）活化通路已被證明是治療TBI 的有效策略[3]，核因子E2 相關因子2（Nrf2）是堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子家族的成員之一，可調節細胞保護因子以應對氧化應激[4]。研究顯示，激活Akt/Nrf2 信號通路對TBI 小鼠神經元損傷具有保護作用[5]。黃芩苷是一種主要來源于高黃芩、黃芩和半枝蓮等草本植物的化學物質，具有抗炎、抗腫瘤等藥理作用[6]。基于此，本研究通過建立TBI 模型大鼠，研究黃芩苷對TBI 模型大鼠以及Akt/Nrf2 信號通路的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級12 周齡SD 大鼠，79 只，體質量（200～220）g，雌雄各半，購自重慶醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（渝）2019-0017，所有大鼠均飼養于清潔級動物房內（溫度：18～25 ℃，相對濕度：60%～70%），自由取食、飲水，自動控制光照/黑暗交替（12 h/12 h）。本研究已獲得醫院倫理委員會審核，批件編號：2021 倫審第017 號。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 黃芩苷（原料藥，純度99.95%，批號24015-13-6）購自南京源植生物科技有限公司；單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液（規格2 mL∶20 mg，批號20200713）購自長春翔通藥業有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液（批號HA5047）、PCR 試劑盒（批號HA1572）、蛋白提取試劑盒（批號HA0155L）、Akt（批 號 HA3027R）、Nrf2（批 號HA3014R）、β-肌動蛋白（β-actin）（批號HA1058R）單克隆抗體、兔抗鼠二抗（批號HA1156R）均購自杭州華安生物技術有限公司；烤箱（型號WTOJM102X）購自美國惠而浦公司；腦創傷打擊器（型號ZH-ZYQ）、顯微鏡（型號CMY-280）、熒光定量PCR儀（型號MA-8000）、凝膠成像系統（型號1880）均購自廣東謹諾科技有限公司。

1.3 動物建模、分組及給藥 參照文獻[7]的方法進行TBI 造模，將大鼠采用乙醚麻醉后固定于腦創傷打擊器上，沿頭皮正中切開，在右側顱骨制作一個直徑5 mm 的骨窗，保持硬腦膜完整，采用腦創傷打擊器將25 g 的砝碼從40 cm 高度處自由落下，撞擊右側顱骨骨窗的硬腦膜，然后止血縫合頭皮，大鼠蘇醒后出現四肢運動不協調、短暫呼吸抑制，表明TBI 造模成功（若大鼠失血過多或者3 h 內死亡，視為造模失敗）。共67 只大鼠參與造模，7 只造模失敗，成功造模60 只大鼠，按隨機數字表法分成模型組、陽性對照組及黃芩苷低、中、高劑量組，每組12 只。另取12只大鼠只制作骨窗，不進行撞擊，設為假手術組。造模后3 h，陽性對照組大鼠肌肉注射14 mg/kg 單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液（用生理鹽水將單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液溶解成濃度為1.4 mg/mL 的溶液，注射體積10 mL/kg）[7]；黃芩苷低、中、高劑量組大鼠分別灌胃50、100、200 mg/kg 的黃芩苷（用生理鹽水將黃芩苷溶解成濃度分別為5、10、20 mg/mL 的混懸液，灌胃體積10 mL/kg）[8]；模型組和假手術組大鼠灌胃10 mL/kg 的生理鹽水；每天給藥1次，連續給藥7 d。給藥期間，模型組大鼠死亡2 只，其余各組大鼠均存活。

1.4 大鼠神經功能缺損評分測定 分別于造模后3 h和末次給藥后2 h，采用改良神經功能缺損評分（mNSS）[9]評定大鼠神經功能受損情況，mNSS 評分包括四個方面：（1）運動試驗、（2）感覺試驗、（3）反射喪失和不正常運動、（4）癲病、肌陣攣、肌張力障礙，總分為18 分，得分越高表示神經功能損害越嚴重。

1.5 大鼠腦組織含水量檢測 mNSS 評分測定完畢后，各組大鼠全部處死，模型組獲取4 只大鼠完整腦組織，其余各組獲取6 只大鼠完整腦組織，稱量完整腦組織重量為濕重，然后將腦組織放在烤箱中（72 ℃，72 h）進行烘干，稱其干重，計算腦組織含水量，腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.6 大鼠腦組織病理結構觀察 取各組剩余6 只大鼠的損傷部位腦組織，分成三部分，一部分腦組織用生理鹽水漂洗后置于甲醛中固定，制作HE 染色切片，觀察各組大鼠腦組織病理結構。

1.7 大鼠腦組織Akt、Nrf2 mRNA 表達水平檢測取1.6 中另一部分腦組織，制成勻漿，Trizol 法提取腦組織總RNA，逆轉錄合成cDNA，然后采用PCR 試劑盒進行反應，Akt、Nrf2 及內參β-actin 引物由武漢轉導生物科技發展有限公司合成，序列如下：Akt 正向5'-GTAGATAAGGTAGTCCGACTCGTAG-3'，Akt 反向5'-ACGTTCCGGACGTGCCATTACGTCT-3'；Nrf2正向5'-CTGAATCGATCCTCGGACGA-3'，Nrf2 反向5'-AGTGAACGGTAGACCTGAAT-3'；β-actin 正 向5'-AGCCATGCCATGAATCACTA-3'，β-actin 反 向5'-CGACGTCACGAATCGAGCTC-3'。擴增條件為：92℃，6 min；38 個PCR 循環（97 ℃，12 s；58 ℃，15 s；62℃，15 s）。2-ΔΔCt法計算腦組織Akt、Nrf2 mRNA 表達水平。

1.8 大鼠腦組織Akt、Nrf2 蛋白表達水平檢測 取1.6 中最后一部分腦組織，制成勻漿，采用蛋白提取試劑盒分離總蛋白，定量蛋白濃度后，上樣20 μg 蛋白進行電泳，然后轉膜，脫脂奶封閉2 h，加入Akt（1∶300）、Nrf2（1∶300）和β-actin（1∶500）單克隆抗體4 ℃孵育24 h，加入兔抗鼠二抗（1∶2000）孵育2 h，磷酸鹽緩沖液洗膜，最后采用凝膠成像系統進行顯影。

1.9 統計學方法 應用SPSS 25.0 統計軟件處理數據，計量資料經檢驗均符合正態分布，采用均數±標準差（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠mNSS 評分比較 造模后3 h，與假手術組比較，其余各組大鼠mNSS 評分均升高（P均<0.05），但其余各組大鼠mNSS 評分之間兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。末次給藥后2 h，與假手術組比較，模型組大鼠mNSS 評分升高（P<0.05）；與模型組比較，陽性對照組及黃芩苷低、中、高劑量組大鼠mNSS 評分均降低（P 均<0.05），且黃芩苷各劑量組之間呈劑量依賴性（P 均<0.05）；陽性對照組和黃芩苷高劑量組大鼠mNSS 評分差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠mNSS 評分比較（分，）

表1 各組大鼠mNSS 評分比較（分，）

注：假手術組灌胃10 mL/kg 生理鹽水；模型組灌胃10 mL/kg 生理鹽水；陽性對照組肌肉注射14 mg/kg 單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液；黃芩苷低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kg 黃芩苷；mNSS 為改良神經功能缺損評分；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，dP＜0.05；與黃芩苷中劑量組比較，eP＜0.05

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織含水量升高（P<0.05）；與模型組比較，陽性對照組及黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腦組織含水量均降低（P 均<0.05），且黃芩苷各劑量組之間呈劑量依賴性（P<0.05）；陽性對照組和黃芩苷高劑量組大鼠腦組織含水量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦組織含水量比較（%，）

表2 各組大鼠腦組織含水量比較（%，）

注：假手術組灌胃10 mL/kg 生理鹽水；模型組灌胃10 mL/kg 生理鹽水；陽性對照組肌肉注射14 mg/kg 單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液；黃芩苷低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kg 的黃芩苷；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，dP＜0.05；與黃芩苷中劑量組比較，eP＜0.05

2.3 各組大鼠腦組織病理結構觀察 假手術組大鼠腦組織細胞結構完整、排列整齊，未見出血及水腫；模型組大鼠腦組織細胞排列松散，且部分細胞點狀壞死，大量炎性細胞浸潤，出血和水腫明顯；黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腦組織出血、水腫面積和點狀壞死細胞數量逐漸減少；陽性對照組和黃芩苷高劑量組效果相近。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理結構圖（HE 染色，×200）

2.4 各組大鼠腦組織Akt、Nrf2 mRNA 表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織Akt、Nrf2 mRNA 表達水平降低（P<0.05）；與模型組比較，陽性對照組及黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腦組織Akt、Nrf2 mRNA 表達水平均升高（P 均<0.05），且黃芩苷各劑量組之間呈劑量依賴性（P<0.05）；陽性對照組和黃芩苷高劑量組大鼠腦組織Akt、Nrf2 mRNA 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠腦組織Akt、Nrf2 mRNA 表達水平比較（）

表3 各組大鼠腦組織Akt、Nrf2 mRNA 表達水平比較（）

注：假手術組灌胃10 mL/kg 生理鹽水；模型組灌胃10 mL/kg 生理鹽水；陽性對照組肌肉注射14 mg/kg 單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液；黃芩苷低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kg 黃芩苷；Akt mRNA 為蛋白激酶B 信使核糖核酸；Nrf2 mRNA 為核因子E2 相關因子2 信使核糖核酸；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，dP＜0.05；與黃芩苷中劑量組比較，eP＜0.05

2.5 各組大鼠腦組織Akt、Nrf2 蛋白表達水平比較與假手術組比較，模型組大鼠腦組織Akt、Nrf2 蛋白表達水平降低（P<0.05）；與模型組比較，陽性對照組及黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腦組織Akt、Nrf2 蛋白表達水平均升高，且黃芩苷各劑量組之間呈劑量依賴性（P<0.05）；陽性對照組和黃芩苷高劑量組大鼠腦組織Akt、Nrf2 蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織Akt、Nrf2 蛋白印跡圖

表4 各組大鼠腦組織Akt、Nrf2 蛋白表達水平比較（）

表4 各組大鼠腦組織Akt、Nrf2 蛋白表達水平比較（）

注：假手術組灌胃10 mL/kg 生理鹽水；模型組灌胃10 mL/kg 生理鹽水；陽性對照組肌肉注射14 mg/kg 單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液；黃芩苷低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kg 黃芩苷；Akt 為蛋白激酶B；Nrf2 為核因子E2 相關因子2；與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＜0.05；與黃芩苷低劑量組比較，dP＜0.05；與黃芩苷中劑量組比較，eP＜0.05

3 討論

黃芩苷是一種黃酮類化合物。研究顯示，黃芩苷能夠修復脫髓鞘疾病小鼠的中樞神經系統，從而改善小鼠的神經功能[10]。Zheng 等[11]研究發現，黃芩苷可改善蛛網膜下腔出血大鼠mNSS 評分和腦含水量，減輕大鼠腦水腫病變，發揮腦保護作用。而腦水腫會導致TBI 大鼠顱內壓升高，是TBI 早期死亡的主要原因[12]。本研究發現，當構建TBI 模型后，會導致大鼠mNSS 評分升高，同時腦組織含水量顯著上升，可能是由于TBI 后繼發腦水腫，壓迫中樞神經，導致大鼠神經功能受損。對TBI 模型大鼠采用黃芩苷進行干預治療后，大鼠mNSS 評分和腦組織含水量降低，提示黃芩苷可能是通過減輕TBI 模型大鼠腦水腫狀態，從而達到改善其神經功能的作用，這與Ai 等[10]、Zheng 等[11]研究結果一致。病理結果顯示，TBI 發生后大鼠腦組織細胞排列松散，且部分細胞點狀壞死，大量炎性細胞浸潤，出血和水腫明顯，提示TBI 后的炎癥反應加重，造成繼發性損傷。而黃芩苷可有效降低大鼠腦組織出血、水腫面積，同時降低炎性細胞數量，表明黃芩苷可能通過抑制炎癥反應來緩解TBI后的繼發性損傷，在TBI 發生的過程中起到保護作用。

Akt/Nrf2 通路是反映腦損傷的關鍵信號通路，Zhu 等[13]研究顯示，銀杏葉提取物能夠激活Akt/Nrf2通路，發揮對腦缺血/再灌注損傷大鼠的神經保護作用。Luo 等[14]研究發現，激活Akt/Nrf2 信號通路可抑制缺氧缺血性腦損傷大鼠腦組織炎癥，減少腦水腫和神經元凋亡，從而發揮神經保護作用。Gou 等[15]研究顯示，褪黑素可通過激活Akt/Nrf2 途徑，增強缺氧缺血性腦損傷大鼠學習和記憶能力，抑制神經元細胞焦亡，發揮腦保護作用。以上研究結果均表明，Akt/Nrf2 通路的激活水平可能與大鼠的神經功能存在密切相關性。本研究結果顯示，TBI 的發生在分子機制方面會導致大鼠腦組織Akt、Nrf2 mRNA 和蛋白表達水平降低，而這也可能是導致炎癥反應加劇的原因之一。黃芩苷治療可提高大鼠腦組織Akt、Nrf2 mRNA 和蛋白表達水平，提示黃芩苷可激活Akt/Nrf2信號通路，而高表達的Akt、Nrf2 可有效抑制機體過強的炎癥反應，從而發揮對TBI 大鼠的腦保護作用。

綜上所述，黃芩苷可改善TBI 模型大鼠腦神經損傷和腦水腫，其機制可能與黃芩苷激活Akt/Nrf2信號通路，促進Akt、Nrf2 mRNA 和蛋白表達有關。