蒲丁顆粒劑的定性鑒別與總黃酮含量測定

劉 輝 楊慶芳

蒲丁合劑是浙江中醫藥大學附屬第二醫院沿用多年的經驗方，醫院制劑室將其制成合劑應用于臨床，療效確切，本合劑由紫花地丁、蒲公英組成，用于治療熱毒所致的急慢性扁桃體炎、上呼吸道感染、腐腫瘡癤及咽喉炎等。中藥傳統合劑是我國應用較早、較廣泛的劑型，然而其貯存不易、攜帶不便等缺點，嚴重制約了其在臨床上的應用和發展[1-2]。為克服以上缺點，在合劑的基礎上，優選出蒲丁顆粒的最佳水提，純化工藝；并通過一系列優選實驗，篩選輔料的種類和用量，確定蒲丁顆粒的成型工藝。同時，對蒲丁顆粒的質量標準進行研究，處方中的蒲公英藥材可采用薄層色譜法[3-4]進行鑒別，并運用紫外分光光度法[5-6]對總黃酮進行含量測定，提高制劑的質量評價系統。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器 硅膠G 板（青島海洋化工），ZF-20D暗箱式-紫外分析儀（鞏義市予華儀器有限責任公司上海分公司），CT-C 型熱風循環烘箱（江蘇先鋒干燥工程有限公司），XS105DU 電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），UV-2550 紫外分光光度計（島津儀器有限公司）。

1.2 實驗試藥 蒲丁顆粒（實驗室自制）；咖啡酸對照品（批號110885-201802）、蒲公英對照藥材（批號121195-201904）、紫花地丁對照藥材（批號121429-201906）、蘆丁對照品（批號100080-201812），中國食品藥品檢定研究院；甲醇試劑（批號2019021002）、乙酸乙酯試劑（批號2019040202）、乙醇試劑（批號2019051502）等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法與結果

2.1 TLC 薄層色譜法蒲丁顆粒中蒲公英的鑒別

2.1.1 供試品溶液、對照蒲公英藥材溶液及陰性對照液的制備 分別精密稱定蒲丁顆粒1 g 及蒲公英對照藥材2 g，加入20 mL 5%甲酸的甲醇溶液中超聲20 min，濾過后蒸干，殘渣中加入10 mL 水使其溶解，濾過后濾液經2 次乙酸乙酯提取，每次10 mL，將兩次提取液混合后蒸干，用1 mL 甲醇將殘渣溶解，作為供試品溶液及對照蒲公英藥材溶液。取除蒲公英以外的其他藥材，按蒲丁顆粒制劑工藝制備陰性顆粒。取陰性顆粒，按以上方法制成陰性對照液。

2.1.2 咖啡酸對照品溶液制備 取咖啡酸對照品，加甲醇配制成濃度為0.5 mg/mL 對照溶液。

2.1.3 對照紫花地丁藥材溶液及不含紫花地丁陰性對照液的制備 分別精密稱定蒲丁顆粒2 g 及紫花地丁對照藥材2 g，加甲醇20 mL，超聲20 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加熱水10 mL，攪拌使溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液及紫花地丁對照藥材。取除紫花地丁以外的其他藥材，按蒲丁顆粒制劑工藝制備陰性顆粒。取陰性顆粒，按以上方法制成陰性對照液。

2.1.4 蒲公英TLC 薄層色譜鑒別 按照《中國藥典》薄層色譜法試驗通則要求，精密量取供試液、蒲公英對照藥材溶液、咖啡酸對照品、不含蒲公英陰性供試品各2 μL，點樣于相同硅膠板上，以甲酸-乙酸乙酯-甲苯（1∶3∶5）的上層液作為展開劑將樣品展開，取出后置于適當位置晾干，波長365 nm 紫外燈下進行檢視。相應位置顯相同的咖啡酸亮色斑點，不含蒲公英陰性供試品無斑點。見圖1。

圖1 蒲丁顆粒中蒲公英色譜圖

2.1.5 紫花地丁TLC 薄層色譜鑒別 按照《中國藥典》薄層色譜法試驗通則要求，精密量取供試液、紫花地丁對照藥材溶液、不含紫花地丁陰性供試品各4 μL，點樣于相同硅膠板上，以甲酸-乙酸乙酯-甲苯（1:3:5）的上層液作為展開劑將樣品展開，取出后置于適當位置晾干，波長365 nm 紫外燈下進行檢視。相應位置顯相同的亮色斑點，不含蒲公英陰性供試品無斑點。見圖2。

圖2 蒲丁顆粒中紫花地丁色譜圖

2.2 蒲丁顆粒中總黃酮含量測定

2.2.1 供試液制備 稱定蒲丁顆粒0.25 g，至25 mL容量瓶，加60%乙醇20 mL 溶解，超聲處理45 min后放冷，稀釋至刻度后定容搖勻，過濾溶液即得。

2.2.2 標準溶液制備 稱定蘆丁標準品20.0 mg，加入60%乙醇液使溶解，于100 mL 容量瓶中定容。準確吸取25 mL 至50 mL 容量瓶中，加60%乙醇液稀釋至刻度后定容搖勻，即得0.100 mg/mL 蘆丁稀釋液。

2.2.3 紫外-可見分光光度法測定總黃酮含量 照紫外-可見分光光度法（通則0401），在413 nm 波長處測定吸光度，精密量取供試品溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，加入0.5%三氯化鋁無水乙醇液5 mL，測定吸光度并按測定吸光度從標準曲線上計算出供試品溶液中總黃酮的含量，即得。

2.2.4 標準曲線及線性關系 分別準確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 標準溶液至25 mL 量瓶中，加入三氯化鋁無水乙醇液（濃度0.5%）5 mL，再加入60%無水乙醇液至刻度，搖勻，放置15 min。以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在413 nm 波長處測定吸光度，質量（根據濃度求得質量為0.0985 mg、0.1970 mg、0.2955 mg、0.3940 mg、0.4925 mg、0.5909 mg）為橫坐標，以對應吸光度A（0.107、0.219、0.324、0.425、0.535、0.629）為縱坐標，得線性方程為Y=1.0615X+0.0073，相關系數R2=0.9995，表明蘆丁在0.0985～0.5909 mg/mL 范圍具有良好的線性關系。

2.2.5 重復性考察 取同一份對照品溶液，于413 nm處測定吸光度值，重復5 次，結果RSD 為0.54%，＜2.0%，符合要求。

2.2.6 穩定性考察 取相同供試品溶液，分別于0.5、1、2 h，測定一次吸收值，結果RSD 為0.65%，＜2.0%，符合要求。

2.2.7 精密度 取同一批樣品，按照相同方法制備6份供試液，進行含量測定，結果RSD 為1.41%，＜2.0%，符合要求。

2.2.8 加樣回收率實驗 取同一批樣品，精密稱取約0.125 g 加入蘆丁對照品溶液6 mL，至25 mL 量瓶，混合均勻，加60%乙醇15 mL 溶解，超聲處理45 min 后放冷，稀釋至刻度后定容搖勻，過濾溶液即得。取上清液備用。上清液同法處理。本法回收率為106.6%，在92%～110%之間，符合要求。見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

3 討論

蒲丁顆粒由蒲公英和地丁組成，蒲公英中包含的有機酸主要有綠原酸、咖啡酸、齊墩果酸等具有抗菌、消炎、抗病毒、利膽保肝、降血脂等藥理作用[7]。文獻報道，對咖啡酸的研究也比較成熟，本實驗中采用薄層層析法以咖啡酸為參比制劑鑒別蒲丁顆粒，預實驗顯示其專屬性也很強，可以作為蒲丁顆粒定性鑒別的參比制劑[8]。研究顯示，蒲公英及紫花地丁中均含有總黃酮[7，9]。蘆丁作為總黃酮含量測定參比制劑的研究也比較成熟，根據實驗室條件進行預實驗，結果顯示，紫外分光光度法對其含量的測定的線性、重復性、精密度、回收率及穩定性驗證結果均較好。以上結果表明，可以采用該方法測定蒲丁顆粒中總黃酮的含量。