跨膜蛋白63C基因遺傳多態性與缺血性腦卒中氣虛證顯著關聯

古聯 梁寶云 周文君 劉永輝 龍建雄 嚴雁 朱路路 蘇莉

(廣西中醫藥大學 1第一附屬醫院腦病科二區，廣西 南寧 530023；2研究生學院；廣西醫科大學 3公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室；4公共衛生學院)

缺血性腦卒中(IS)系由機體“內傷積損頹敗”，又遇風、火、痰、瘀等邪氣而發，屬于祖國醫學“中風”的范疇。中醫診斷的過程強調“辨證”，以“望、聞、問、切”四診收集的資料為作為辨證診斷依據，診斷過程可能會受個人知識儲備及臨床經驗等的主觀認識干擾，缺乏客觀依據的指導，故探尋證候診斷的物質基礎以實現“精準證候”是亟待解決的問題。基因組學研究認為，中醫證候的形成存在分子遺傳學基礎〔1〕，基因多態性可能是不同疾病如不寐、高血壓等不同證型診斷的依據〔2,3〕。跨膜蛋白(TMEM)63C基因存在于人體的第14號染色體上，由其指導合成的蛋白可參與高滲激活離子通道結構的構成，介導細胞內外離子的轉運過程〔4〕，調節細胞內外離子的平衡狀態，進而影響腦卒中早期腦組織的病理變化過程〔5〕。目前關于跨膜蛋白家族相關基因的文獻報道主要集中在腫瘤方面的探索上，關于TMEM63C基因遺傳多態性與IS中醫證候要素關聯的研究尚未見報道。本研究以中國南方漢族人為研究對象，基于病例對照的研究方法，通過探索TMEM63C基因遺傳多態性與IS中醫證候要素之間的關系，旨在為IS的中醫辨證診斷及分型提供客觀的參考依據和物質基礎。

1 資料與方法

1.1研究對象 病例組：來源于廣西中醫藥大學第一附屬醫院住院治療的IS患者，共計774例。納入標準：所有納入病例組的研究對象發病時間均在7 d以內，由兩名主治及以上職稱的神經內科醫師在頭顱CT和(或)磁共振成像(MRI)頭顱平掃檢查的輔助下明確診斷；所有病例組患者的診斷必須同時符合IS的中、西醫診斷標準，其中中醫診斷符合《中風病診斷療效評定標準(試行)》(1994年國家中醫藥管理局腦病急癥科研協作組制定)的診斷標準，西醫診斷則參照《各類腦血管疾病診斷要點》(1996年中華醫學會第四次全國腦血管病學術會議修訂版)中腦卒中的相關診斷標準進行診斷；中國南方的漢族患者。排除標準：由動脈炎、血液病、腦外傷、腫瘤、腦血管畸形、藥物等引起的腦卒中；其他特殊類型的腦卒中，如出血性腦卒中、腦梗死昏迷或失語、短暫性腦缺血發作等；合并嚴重肝腎功能不全、血液系統疾病、重度休克或不能合作完成各項資料的收集及相關指標測定的患者。

對照組：來源于同時期同醫院體檢中心參加體檢的正常人及骨科住院輕癥患者，共計793例。納入標準：既往無腦卒中等腦血管疾病病史者；各系統均無重大疾病者；性別、年齡的分布與病例組相匹配者；中國南方的漢族人。排除標準：既往有心腦血管疾病史或家族史的患者；因精神、語言等因素無法合作者完成資料收集者。

病例組男459例、女315例，對照組男437例、女356例；兩組差異無統計學意義(χ2=2.815，P=0.093)。病例組平均年齡(64.12±10.34)歲，對照組平均年齡(63.81±10.36)歲，兩組差異亦無統計學意義(t=-0.582，P=0.561)。本研究所納入研究的對象相互間均不存在血緣關系，并簽署知情同意書且自我報告三代以內均為的中國漢族人。本研究方案交由廣西醫科大學倫理委員會進行審核并通過。

1.2中醫辨證 依據《中風病辨證診斷標準》(1996年國家中醫藥管理局腦病急癥科研組頒發)中的中醫證候診斷量表，對納入的IS患者進行中醫證候診斷評分，按照評分結果判定相應的中醫證候。該辨證診斷量表分為6個基本證候要素(分別為風證、火熱證、痰證、血瘀證、氣虛證、陰虛陽亢證)，將診斷某一證候各項要點所得的最高分相加作為該證候的得分，得分≥7分，則為該證候診斷成立。診斷過程由兩名經統一培訓、具有主治醫師或以上職稱的腦病科中醫師，在IS患者起病7 d內進行評分，根據證候評分診斷中醫證候。若出現兩名中醫醫師對同一患者的證候辨證診斷結果不統一，則立即交由第3名具有副主任醫師以上職稱腦病科的中醫醫師進行最終的證候診斷。中醫辨證結果(同一患者可同時存在多個證候要素)：風證318例、火熱證88例、痰證351例、血瘀證177例、氣虛證89例、陰虛陽亢證17例。因陰虛陽亢證樣本量過少，故不進行基因多態性位點與該證型的遺傳關聯分析。

1.3基因分型 以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管抽取研究對象2 ml清晨空腹外周靜脈血，通過北京艾德萊生物科技有限公司(Aidlab biotechnologies CO.Ltd)的全血基因組DNA提取試劑盒進行全血基因組DNA的提取，使用NanoDrop2000儀器檢測全血基因組DNA的OD值及1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測法對全血基因組DNA進行質檢，質檢合格后的全血基因組DNA轉移至-80℃的低溫冰箱凍存以備用。引物設計PCR和單堿基擴展引物則交由生物公司采用 AssayDesigner3.1 軟件進行合成。對收集的全血基因組DNA樣本采用MassARRAY SNP技術進行基因分型檢測。對其中5%樣本的DNA樣本進行基因分型重復檢測，檢測過程采用盲法，即事先未告知實驗操者樣本的病例、對照分組情況，兩次檢測符合率為100%。

1.4血脂水平、凝血標志物及血尿酸水平的測定 采用非抗凝管和抗凝管分別抽取研究對象各2 ml清晨空腹外周血，運用HITACHI日立7600全自動生化分析儀，對其中2 ml非抗凝血進行血脂水平〔包括總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)等生化指標〕及尿酸(UA)水平的測定；另取2 ml抗凝血，分別采用邁瑞6900全自動血細胞分析儀和法國StAgO Capact血凝儀對血小板(PLT)水平及凝血功能指標〔包括活化部分凝血酶原時間(APTT)、D-二聚體(D-D)、纖維蛋白原(FIB)、國際標準化比率(INR)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶原時間活動度(PTA)、凝血酶時間(TT)等〕進行測定。其中血小板的測定采用電極阻抗聚集度測定法(MEA)，凝血功能相關指標的測定采用凝固法。各指標的測定過程均嚴格按照標準化實驗程序的要求進行。

1.5統計學分析 本研究中涉及的遺傳關聯分析采用PLINK軟件進行。其中，哈溫平衡(HWE)的檢驗采用擬和優度χ2檢驗；基因型頻率分布的組間比較采用χ2檢驗；各遺傳模型(加性模型、顯性模型、隱性模型、等位基因型)與疾病的關聯分析采用非條件多因素 Logistic 回歸模型，并計算關聯強度，以OR值及 95%置信區間(CI)表示；使用一般線性模分析基因多態性位點與疾病數量性狀的關聯。其他資料的統計分析采用SPSS18.0軟件進行，以χ2檢驗進行計數資料的組間比較，通過t檢驗或方差分析進行正態分布計量資料的組間比較，非參數法進行非正態分布計量資料的組間比較。本研究涉及的統計學檢驗均為雙側檢驗。

2 結 果

2.1TMEM63C基因rs383459、rs3813539多態性位點的HWE檢驗及基因型頻率分布比較 TMEM63C基因rs383459(PHWE=0.645)、rs3813539(PHWE=0.817)多態性位點在對照組中的基因型頻率分布均符合HWE定律。rs383459的基因型頻率在氣虛證組與對照組之間的分布差異具有統計學意義(P<0.05)，但在風證、火熱證、痰證、血瘀證等證候組與對照組之間的分布差異無統計學意義(均P>0.05)；rs3813539的基因型頻率在氣虛證組與對照組之間的分布差異亦具有統計學意義(P<0.05)，但在風證、火熱證、痰證、血瘀證等證候組中與對照組之間的分布差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 TMEM63C基因rs383459、rs3813539多態性位點的基因型頻率分布比較(n)

2.2TMEM63C基因rs383459、rs3813539多態性與IS及其中醫證候要素發生風險的關聯分析 風證、痰證、血瘀證、氣虛證、火熱證、陰虛陽亢證證候要素分別為：318例(41.09%)、351例(45.35%)、177例(22.87%)、89例(11.50%)、88例(11.37%)、17例(2.20%)。TMEM63C基因多態性位點rs383459與IS氣虛證的易感性顯著關聯〔加性模型：OR(95%CI)=1.46(1.07～2.01)，P=0.019；隱性模型：OR(95%CI)=1.97(1.15～3.38)，P=0.014；等位基因模型：OR(95%CI)=1.46(1.06～2.00)，P=0.018〕，校正性別、年齡后，關聯仍具有統計學意義〔加性模型：ORadj(95%CI)=1.46(1.06～2.01)，Padj=0.021；隱性模型：ORadj(95%CI)=1.98(1.15～3.40)，Padj=0.014〕。多態性位點rs3813539與缺血性中風氣虛證的發生風險亦顯著關聯〔加性模型：OR(95%CI)=1.55(1.08～2.22)，P=0.017；顯性模型：OR(95%CI)=1.56(1.00～2.44)，P=0.049；隱性模型：OR(95%CI)=2.43(1.02～5.75)，P=0.044；等位基因模型：OR(95%CI)=1.54(1.08～2.20)，P=0.017〕，校正性別、年齡后，關聯仍具有統計學意義〔加性模型：ORadj(95%CI)=1.57(1.09～2.25)，Padj=0.015；顯性模型：ORadj(95%CI)=1.59(1.02～2.48)，Padj=0.043；隱性模型：ORadj(95%CI)=2.48(1.04～5.91)，Padj=0.040〕。但在所有遺傳模型中，rs383459、rs3813539多態性與風證、火熱證、痰證、血瘀證的發生風險無統計學關聯(均為P>0.05)。

2.3TMEM63C基因rs383459、rs3813539多態性與IS患者中醫證候要素評分的關聯分析 風證、痰證、血瘀證、氣虛證、火熱證、陰虛陽亢證證候要素評分分別為：(9.53±2.75)分、(9.99±2.51)分、(8.63±1.73)分、(7.94±1.61)分、(8.80±1.91)分、(11.17±3.67)分。TMEM63C基因多態性位點rs3813539與IS氣虛證評分顯著關聯〔加性模型：β(95%CI)=0.39(0.05～0.74)，P=0.027〕；校正性別、年齡后，關聯仍具有統計學意義〔加性模型：βadj(95%CI)=0.39(0.04～0.74)，Padj=0.027〕。但多態性位點rs383459與IS風證、火熱證、氣虛證、痰證、血瘀證等證候要素評分的關聯均無統計學意義(均P>0.05)。

2.4TMEM63C基因rs383459、rs3813539多態性與IS患者血脂水平的關聯分析 兩組血脂水平數據見表2。兩組TC、TG、HDL-C、LDL-C、載脂蛋白A1差異有統計學意義(P<0.05)。校正性別、年齡后，TMEM63C基因多態性位點rs383459與IS患者的TG水平具有統計學關聯〔隱性模型：βadj(95%CI)=0.19(0.01～0.37)，Padj=0.040〕。而多態性位點rs3813539與IS患者的HDL、LDL、VLDL、TC、TG水平之間均無統計學關聯(均為P>0.050)。

2.5TMEM63C基因rs383459、rs3813539多態性與IS患者凝血標志物的關聯分析 兩組凝血功能指標數據見表2。兩組PT、INR、PTA、APTT、TT、FIB差異有統計學意義(P<0.05)。校正性別、年齡后，TMEM63C基因多態性位點rs383459多態性與IS患者的PTA指標顯著相關〔隱性模型：βadj(95%CI)=3.79(0.08～7.51)，Padj=0.047〕，但與FIB、PT、D-D、TT、APTT、INR、PLT等凝血指標之間均無統計學意義(均為P>0.050)；多態性位點rs3813539與IS患者PTA、FIB、PT、D-D、TT、APTT、INR、PLT等凝血指標之間的關聯亦無統計學意義(均為P>0.050)。

2.6TMEM63C基因rs383459、rs3813539多態性與IS患者尿酸(UA)水平的關聯分析 兩組UA數據見表2。IS組UA水平顯著高于對照組(P<0.05)。TMEM63C基因多態性位點rs3813539與IS患者的UA水平顯著關聯〔加性模型：β(95%CI)=-13.35(-26.49～0.21)，P=0.047；隱性模型：β(95%CI)= -39.10(-77.67～-0.53)，P=0.047〕，校正性別、年齡后，關聯仍有統計學意義〔加性模型：βadj(95%CI)= -13.39(-26.54～0.23)，Padj=0.046；隱性模型：βadj(95%CI)=-39.24(-77.92～-0.55)，Padj=0.047〕。

表2 兩組臨床指標比較

3 討 論

TMEM 63C是TMEM63C基因的表達產物，該蛋白主要與TMEM63A、TMEM63B共同形成一個高滲激活的離子通道結構，在高滲刺激狀態下參與細胞膜表面滲透壓受體信號轉導的過程，通過感受細胞內外滲透壓的變化參與調節細胞內外離子轉運及平衡〔6〕。離子轉運蛋白功能障礙和離子穩態失衡可影響神經毒性信號通路的轉導，進而調節細胞水腫、凋亡及自噬等細胞退化的過程，是腦缺血腦組織損傷的早期病理改變〔5，7〕。TMEM 63C屬于TMEM蛋白家族的成員之一，與其相類似的還有糖基化蛋白(TMEM9B)、神經毒素(TMEM16)、LR8(TMEM176B)、RAS誘導衰老蛋白(TMEM158)等，綜合現有的功能報道，TMEM家族蛋白在體內可參與如離子通道質膜的組成、信號轉導通路的激活、細胞趨化、黏附及凋亡過程的介導等多項生理病理的變化過程〔8，9〕。細胞趨化、黏附、凋亡時沉積于血管內皮下，釋放炎癥因子，致使血管內皮損傷發生慢性炎癥，促使或加速動脈粥樣硬化的發生、發展，而動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中發病的重要危險因素和病理基礎。TMEM63C最終可能通過上述途徑來影響和參與腦卒中的發生、發展過程。雖然本研究未發現TMEM63C基因rs383459、rs3813539兩個多態性位點與IS的發生風險相關，但發現這兩個多態性位點均與IS氣虛證的發生風險顯著關聯，與IS風證、火熱證、痰證、血瘀證的發生風險無關聯。

IS是一種異質性疾病，其在病因、臨床表現、病情的進展、預后及對治療藥物的敏感性等方面均存在著群體差異〔10，11〕。如臨床上依據IS的病因特點，可將其分為大動脈粥樣硬化型、心源性栓塞型、小動脈閉塞型及其他病因型等，依據腦卒中發生后的臨床表現又可分為完全前循環梗死、部分前循環梗死、后循環梗死、腔隙性梗死等，還可依據病程及預后的不同分為腦梗死急性期、腦梗死恢復期及腦梗死后遺癥期。現代基因組學研究發現，疾病的異質性是在遺傳因素與環境因素共同作用下相互影響的結果〔12〕。如Das等〔13〕報道TLR4基因C1196T多態性與顱內大動脈粥樣硬化型腦卒中顯著關聯，但與顱外大動脈硬化型腦卒中、腔隙性腦梗死的發生無關聯；胥麗霞等〔14〕學者也發現COX-1上C50T基因突變會增加阿司匹林抵抗(RA)的風險。由此說明，IS疾病異質性具有分子遺傳學基礎。

中醫對疾病的認識以辨證論治的思想原則為基礎，“證候”是中醫對疾病在發生發展過程中某一階段的病因、病位、病性及病勢等總的病理概括，不同的人患同一疾病或同一疾病的不同階段，其所形成的證候亦因人、因時而異，即“同病異證”，是疾病個體多樣性的體現。遺傳多態性是種內群體間或群內個體間多態現象的根本原因，包括染色體多態性、酶和蛋白質多態性、抗原多態性、單核苷酸多態性(SNP)等五類，其中SNP是最常見的多態性類型。可見，“同病異證”與疾病遺傳多態性有著相通之處。縱觀中醫體質學說與現代基因組學，二者均存在遺傳的本質，均受遺傳因素和環境因素的影響，體質是證候的內在基礎，證候的形成亦受遺傳因素的影響，基因-體質-證候之間存在著必然聯系〔15,16〕。近年來越來越多的觀點支持中醫證候的形成與基因遺傳多態性有關，并且某些基因表現的證候特異性可作為疾病中醫辨證的物質基礎，如轉化生長因子(TGF)-β1基因rs4803455位點的AC基因型與類風濕關節炎肺間質病變肺腎氣虛證密切相關〔17〕，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1基因rs9340多態性可增加男性IS風痰瘀阻證的發生風險，但對IS氣虛血瘀證的易感性無影響〔18〕。本研究發現，TMEM63C基因rs3813539多態性位點均與IS氣虛證的易感性、證候評分顯著關聯，與風證、火熱證、痰證、血瘀證等其他中風中醫證候要素均無關聯，本研究的結果與既往的研究成果一致，均支持中醫證候具有分子遺傳學基礎。

腦卒中的病機總屬本虛標實。早在清代，著名醫家王清任就明確指出“半身不遂,虧損元氣,是其本源……若元氣一虧,經絡自然空虛……氣虧得半身不遂,以致跌仆〔19〕”。醫籍《雜病源流犀燭》中亦有記載:“曰痰曰火,總由于虛,故虛為中風之根也〔20〕”。體質是人體生命在遺傳基礎上形成具有相對穩定的形態結構、生理功能、代謝等特征的表現，45歲以上年齡段人群體質以虛為主〔21〕。可見，正氣虧虛是IS發生的關鍵及根本病理基礎，風證、火熱證、痰證、血瘀證等證候的產生均是在氣虛的基礎上變生而成〔22〕。血脂、凝血及UA等生化指標分別是中醫痰、瘀、濕的物質體現〔23，24〕。基因組學認為，人體內的血脂、凝血、UA等生化指標的代謝受基因多態性的調節。如Verbeek等〔25〕發現TRIB1基因rs2954029位點多態性與人體內TG水平顯著相關，rs7094081多態性位點與人體內的凝血指標關系密切〔26〕，冠心病相關基因C6orf105 rs6903965多態性與漢族人群的無癥狀型高尿酸血癥顯著關聯〔27〕。本研究也發現，TMEM63C基因rs383459多態性與IS患者的TG水平和PTA指標顯著相關，rs3813539與IS患者的UA水平顯著關聯，提示TMEM63C基因多態性可能影響血脂、凝血及UA等IS危險因素的代謝及病理過程，進而影響IS的發生及證候演變的過程。

本研究以“精準醫療計劃”為研究背景，從基因組學的角度探索腦卒中中醫證候的物質基礎，發現TMEN63C基因多態性僅與IS虛證顯著關聯，與其他中醫證候要素均無關聯，為中醫“同病異證”理論提供了物質支持，為IS“精準證候”診斷提供了客觀依據。