黃芪桂枝五物湯治療類風濕關節炎網絡藥理學及分子對接技術

郭嘉 卞華 單雨 趙晶晶 張瀟文 陳爽 卞博

(1河南中醫藥大學，河南 鄭州 450000；2南陽理工學院張仲景國醫國藥學院 河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室)

類風濕關節炎(RA)主要累及關節，但仍應認為是一種包括關節外表現的綜合征，如類風濕結節、肺部受累或血管炎及全身并發癥〔1〕。RA有著嚴重的社會經濟負擔，除了主要的直接醫療費用外，還有功能殘疾、工作能力減少和社會參與度下降的結果〔2〕。甲氨蝶呤通常是RA的一線藥物，生物制劑如腫瘤壞死因子抑制劑，通常被認為是二線藥物或可以添加雙重治療〔3〕。雖然現代醫學已經取得了不錯的進展，但由于藥物療效的不確切性及不良反應的可預見性，我們仍需不斷完善和挖掘新的治療策略以改善RA患者預后。

中醫認為RA屬“痹證”范疇，歷代醫家又稱其為 “血痹”“鶴膝風”“白虎歷節”等。漢代張仲景在《金匱要略》中指出：“血痹，陰陽俱微，寸口關上微，尺中小緊，外證身體不仁，如風痹狀，黃芪桂枝五物湯(HQGZ)主之。”有關Meta分析顯示〔4〕，HQGZ聯合西藥治療類風濕關節炎比單用西藥有更好的療效，且不良反應顯著降低。多項臨床研究〔5～7〕顯示，HQGZ在RA治療中具有顯著的減毒增效作用。劉佳維等〔8〕研究表明，HQGZ能明顯減輕模型組大鼠關節炎癥、滑膜增生、血管翳形成及軟骨破壞,其機制可能與調控janus激酶信號轉導和轉錄激活物(JAK-STAT)信號通路中白細胞介素(IL)-2、JAK3、STAT3、細胞因子信號傳導抑制因子(SOCS)1、SOCS3的表達相關。中西醫結合治療類風濕關節炎突破中西藥各自用藥治療的局限性，可提高療效，降低致殘率，提高生活質量〔9〕，因此對于中醫藥防治RA的作用機制仍需進一步探究。目前HQGZ治療RA的具體機制尚不清楚，本研究旨在探討HQGZ對RA的作用機制。

1 材料與方法

1.1RA靶點獲取 通過GEO數據庫，以“Rheumatoid arthritis”為關鍵詞進行搜索相關芯片，獲取GSE93272、GSE93776的芯片數據原始文件和GPL570-55999的芯片基因注釋文件。GSE93272芯片包含了275個樣本，其中232個來自RA患者，43個來自健康人群；GSE93776包含173個樣本，其中83個來自RA患者，90個來自健康人群。使用R軟件對數據進行處理，過濾條件為|logFC|>0.5，P值<0.05，獲得RA潛在靶點并分別繪制熱圖。登錄OMIM數據庫和Genecard數據庫，輸入“Rheumatoid arthritis”檢索獲取RA靶點基因。最后去除重復靶點，整合獲得RA靶點。

1.2HQGZ靶點獲取及靶點預測 登錄TCMSP數據庫，分別輸入黃芪、桂枝、芍藥、生姜和大棗，以口服利用度(OB)>30%，類藥性(DL)>0.18為過濾條件進行篩選，并獲取其所對應的靶點。通過Uniprot數據庫對所獲得的基因進行標準化命名。將RA靶點與HQGZ靶點取交集，獲取有效靶點。使用Cytoscape軟件構建藥物-有效成分-靶點網絡圖。

1.3蛋白互作(PPI)網絡構建及拓撲分析 將預測的有效靶點輸入String數據庫，進行PPI分析，過濾條件為最低互動得分要求>0.9，除去在網絡中無連接的點，獲得PPI網絡圖。保存TSV文件，使用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件進行拓撲分析，過濾條件為中介中心度、接近中心度、程度中心性、特征向量中心度、基于局部平均連接度的方法、信息中心度及網絡中心性，每次過濾選取大于中位值的節點，最終獲取核心基因。

1.4分子對接驗證 將獲取的核心基因BC排名前3的靶點與網絡圖中DC排名前6的有效成分分別進行分子對接驗證。登錄PDB數據庫下載靶點的空間結構，去掉小分子配體。登錄Pubchem數據庫，下載有效成分2D結構。經Autodock軟件處理后獲取PDBQT文件，進行分子對接。選取結合能最小的組合使用PYMOL軟件繪圖。

1.5基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析 將預測的有效靶點通過R軟件中的ClusterProfiler包〔10〕對獲得的RA潛在靶點進行GO的生物過程(BP)、分子功能(MF)、細胞組份(CC)和KEGG通路分析，對P值進行錯誤發現率(FDR)矯正獲得adjP的值，設置閾值adjP<0.05為過濾條件。并繪制排名靠前的通路圖。

2 結 果

2.1RA潛在靶點 通過GSE93776、GSE93272的芯片數據對比RA患者與健康人基因差異，分別獲取差異基因115個和238個，繪制熱圖，見圖1、圖2。登錄Genecard數據庫、OMIM數據庫，輸入關鍵詞“Rheumatoid arthritis”，分別獲取RA靶點4 157個靶點、48個靶點。刪除重復基因，整理后獲得4 439個靶點基因。

圖1 GSE93272

圖2 GSE93776

2.2HQGZ治療RA有效靶點預測 獲取有效成分黃芪20個、桂枝7個、芍藥13個、生姜5個及大棗29個，其中槲皮素為黃芪、大棗共有成分，山柰酚為黃芪、芍藥共有成分，β-谷甾醇為桂枝、芍藥、生姜、大棗共有成分，豆固醇為生姜、大棗共有成分，(+)兒茶素為大棗、桂枝、芍藥共有成分，谷甾醇桂枝、芍藥共有成分，丁子香萜為黃芪、芍藥、大棗共有成分。所對應作用靶點去除重復并經Uniprot數據庫標準化命名后共獲取213個。將HQGZ靶點與RA靶點取交集獲取147個有效靶點。使用Cytoscape軟件繪制中藥-有效成分-靶點網絡圖，見圖3。發現槲皮素、山柰酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇，芒柄花黃素、異鼠李素、β-胡蘿卜素在網絡中度值較高，為主要有效成分。

(中心矩形節點為HQGZ中藥有效成分，圓形標記中生姜深藍色，黃芪黃色，桂枝綠色，大棗紅色，芍藥淺藍色；兩個同心圓節點為靶點。網絡中節點大小與其在網絡中的度值呈正相關)圖3 中藥-有效成分-靶點網絡

2.3PPI網絡構建及核心靶點篩選 將預測的有效靶點輸入String數據庫進行PPI網絡構建。通過Cytoscape軟件進行拓撲分析，篩選出核心靶點JUN、MYC、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)14、MAPK1、RELA、MAPK8、細胞周期素(CCND)1、蛋白激酶B(Akt)1、雌激素受體(ESR)1、腫瘤蛋白(TP)53、連環蛋白(CTNN)β1、NF-κB抑制劑α(NFKBIA)。

2.4分子對接驗證 將核心靶點前3的JUN、MYC、MAPK14靶點分別與HQGZ主要有效成分槲皮素、山柰酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇，芒柄花黃素、異鼠李素、β-胡蘿卜素做分子對接。結果見表1。若結合能<0，表明配體分子均能和受體蛋白自發地結合，結合能越小對接越好。據表中數據可知，最低結合能均≤-5.9 kCal/mol，說明配體與受體蛋白結合性良好。其中MAPK14與Beta-carotene對接為最低結合能。

表1 分子對接結果

2.5GO和KEGG通路分析 將有效靶點標注后，作流體切應力與動脈粥樣硬化通路圖見圖4及PI3K-Akt信號通路圖見圖5。將預測靶點進行GO和KEGG通路富集分析，將富集結果排名靠前的結果作圖，見圖6，圖7。通過GO功能富集分析得到 GO條目2 652個(P<0.05)，其中BP條目2 348個，涉及應激反應、細胞過程、代謝過程、生物調節等方面；CC條目96個，涉及細胞、細胞組分、細胞器等方面；MF相關的條目208個，涉及轉錄調節活性、結合活性、分子功能調節、催化活性等方面。KEGG通路富集分析顯示HQGZ治療RA涉及161條通路，且通路之間相互交叉影響。

圖4 流體切應力與動脈粥樣硬化通路

圖5 PI3K-Akt信號通路

圖6 有效靶點GO富集分析

圖7 有效靶點KEGG通路富集分析

3 討 論

中醫認為素體正氣虧虛是RA產生的先決條件，加之風、寒、濕三邪侵襲機體，正氣虧虛無力驅邪外出，使病邪稽留體內，病久成瘀，加之濕邪纏綿，因而病勢纏綿難愈。首批全國名老中醫婁玉鈴等〔11〕就曾提出治療風濕病當從“虛、邪、瘀”三方面出發。HQGZ中以黃芪為君，益氣活血、溫陽化濕，佐以桂枝溫陽散寒、和血通絡，合白芍養血緩急，柔筋止痛，重用生姜助桂枝祛風散寒、溫經止痛，加以大棗調和脾胃，生化氣血，配方精簡共奏益氣養血、溫經通絡、和血通痹之功效。

纖維母細胞樣滑膜細胞(FLSs)的異常遷移和侵襲是RA最主要的發病機制之一，研究顯示〔12〕槲皮素可通過調控miR-146a/GATA6軸抑制FLSs的遷移和侵襲。槲皮素還可抑制IL-17刺激的RA-FLS中RANKL的產生和IL-17刺激破骨細胞的形成，降低Th17的分化〔13〕。有臨床研究顯示〔14〕每天服用500 mg槲皮素，持續8 w，可以顯著改善RA患者的臨床癥狀、疾病活性，降低血漿高敏感性腫瘤壞死因子水平和健康評估問卷評分。同樣，山柰酚在治療RA中可以抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡,通過抑制核因子(NF)-κB和Akt/mTOR通路改善炎癥RA-FLS〔15〕。另一項研究表明〔16〕，山奈酚可通過阻斷MAPK通路的激活抑制了FLSs在RA中的遷移和侵襲。氧化損傷與RA和系統性紅斑狼瘡的發病機制有關，Comstock等〔17〕曾研究發現，RA或系統性紅斑狼瘡患者血清中α-生育酚、β-胡蘿卜素和視黃醇的濃度低于非RA或系統性紅斑狼瘡患者，即抗氧化狀態是RA的危險因素。篩選出核心靶點后進行分子對接，結果顯示受體與配體結合度緊密，從側面驗證了本研究預測的準確性。本研究發現HQGZ治療RA可能是通過多成分多靶點共同作用，起到抗炎止痛、調節免疫的功效。

RA患者的心血管事件是一般人群的1.5～2.0倍，心血管事件是RA患者死亡的主要原因〔18〕。炎癥是RA的一個特征，會導致內皮細胞(ECs)的激活，活化的ECs通過增加白細胞黏附分子的表達而誘發動脈粥樣硬化〔19〕。本研究顯示HQGZ治療RA富集程度較高的通路中流體切應力與動脈粥樣硬化通路居第一。研究發現內皮細胞通過縫隙連接蛋白血小板/內皮細胞黏附分子1、細胞表面糖萼、初級纖毛、離子通道、小窩和G蛋白、細胞骨架蛋白和整合素〔20,21〕等機械傳感器識別切應力。在機械傳感的基礎上，剪切力通過誘導細胞信號事件的級聯和改變基因表達模式來調節內皮功能和結構。其中通過產生和清除活性氧(ROS)和一氧化氮來調節氧化還原平衡是切應力作為一種有效的促動脈粥樣硬化或抗動脈粥樣硬化刺激的關鍵機制〔22〕。現已有研究〔23,24〕表明，黃芪桂枝五物湯聯合西藥在治療心肌梗死方面能夠顯著降低氧化應激反應指標水平,降低過氧化損傷程度,保護血管內皮功能，增強治療效果,改善心功能和中醫證候,減少心血管不良事件發生。這也從側面驗證了HQGZ可能在治療RA過程中不僅能夠起到抗炎、調節免疫的功效，也能夠改善RA患者的心血管風險，改善患者預后。

PI3K-Akt信號通路是已知與RA發病聯系較為密切通路之一。RA的病情進展主要表現為成纖維滑膜細胞大量增殖分化，產生炎癥因子及基質金屬蛋白酶(MMPs)，激活血小板，并刺激血小板微顆粒向關節腔中釋放血小板活化產物，進而激活PI3K/Akt通路，影響多種下游效應分子的激活過程，從而抑制滑膜細胞自噬〔25〕。有研究顯示RA患者滑膜細胞中Akt存在過度表達，而PI3K作為Akt的上游分子，能夠活化Akt。Akt通過磷酸化激活多種靶蛋白產生抑制細胞凋亡的效應〔26,27〕。因此HQGZ可能通過抑制PI3K/Akt信號通路進而促進成纖維滑膜細胞凋亡并抑制其異常增殖的作用。從通路圖中我們可以看到通路涉及多項炎癥及免疫相關通路如MAPK信號通路、NF-κβ信號通路、細胞凋亡通路、細胞黏附分子通路、p53信號通路、VEGF信號通路、Toll樣受體信號通路等。同時在人類巨細胞病毒感染通路方面，已有研究表明巨細胞潛伏感染的存在會影響RA臨床病程和預后〔28～30〕。

本研究可知HQGZ治療RA是通過多成分多靶點作用于多通路后的共同結果，且在治療過程中可能會減輕心血管并發癥，提高患者預后，這也正體現了中醫異病同證、異病同治的思想。本研究結果為今后挖掘HQGZ治療RA的作用機制提供了理論依據和數據支撐。因數據庫使用有限，可能造成結果存在差異，有待進一步實驗驗證。