黃芩提取物對肺結核大鼠免疫功能的調控作用

孔金玲 黃銀秋 王笑 張慧群

(1長沙市第一醫院感染科，湖南 長沙 410005；2重慶市公共衛生醫療救治中心)

肺結核是肺部受到結核分枝桿菌感染造成的具有傳染性的呼吸系統疾病，病灶主要常見于支氣管、氣管、肺組織、胸膜部位〔1〕。結核分枝桿菌屬于胞內寄生菌中的一類，主要存在于巨噬細胞內，表現于肺泡中，會導致肺部出現病變，若未及時治愈，可能會導致肺部癌變，造成不可挽回的后果〔2〕。一旦人體免疫力大幅度降低時，病菌則會向機體各器官侵襲，入侵肺部時，就會引起肺部結核感染，會表現出咳嗽、發熱等癥狀〔3〕。據不完全資料統計，如今肺結核的死亡率僅次于免疫缺陷病毒性疾病，具有起病急、治療困難、延遲時間長、復發率高的特點〔4，5〕。本文探究黃芩提取物對肺結核模型大鼠免疫功能的調控作用。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 45只SPF級SD大鼠，雌雄各半，購自河南環宇康禾生物科技有限公司，動物許可證：SCXK(豫)2020-0004。6～9月齡，平均(7.13±1.42)月齡，體重245～310 g，平均(263.63±30.87)g，光照12 h/d，在濕度27%～36%、溫度(29.93±4.27)℃的環境中喂養1 w。主要試劑：黃芩提取物(南京道斯夫生物科技有限公司，貨號：dasf1545)，CD4+/CD8+、CD4+、CD8+(上海然哲儀器設備有限公司，貨號：NovoCyt)，糖類抗原(CA)125、白細胞介素(IL)-10、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海梵態生物科技有限公司，干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒購自上海彩佑實業有限公司，轉化生長因子(TGF)-β ELISA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司，IL-6及TNF-α ELISA試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，轉錄因子(TCF)抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號:FNAB08552)，糖原合成酶激酶(GSK)-3β抗體(武漢益普生物科技有限公司，貨號：ATA30403)，β-catenin抗體(深圳欣博盛生物科技有限公司，貨號：ATA40133)。

1.2方法

1.2.1分組及建模 將45只SPF級SD大鼠分為正常組、模型組、低劑量組、中低劑量組、高劑量組各9只，其中正常組不進行處理，剩余4組參照王青樂等〔6〕研究構建肺結核模型：使用標準人型結核菌株H37Rv在ABSL-3級實驗室使用滴鼻法進行感染處理，菌液濃度為1×107CFU/ml，各組大鼠均滴鼻20 μl,建立肺結核大鼠模型。

1.2.2給藥 建模成功后正常組、模型組均給予3 ml生理鹽水，低劑量組給予1.5 g/kg黃芩提取物，中劑量組給予3.0 g/kg黃芩提取物，高劑量組給予6.0 g/kg黃芩提取物，1次/d，均連續灌胃2 w后觀察大鼠變化。

1.2.3病理組織學觀察 將大鼠全麻后行斷頭法處死，在低溫、無菌條件下取大鼠肺組織，將肺組織用4%多聚甲醛中浸泡、固定，室溫下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水后用石蠟進行包埋，作3 μm切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色處理，使用光學顯微鏡觀察大鼠脊髓病理變化。

1.2.4CD4+/CD8+、CD4+、CD8+水平檢測 取大鼠尾靜脈血2 ml，使用肝素鈉行抗凝處理，使用流式細胞儀檢測，將EDTA抗凝外周靜脈血100 μl加入4個試管中,1個試管加入CD和CDg雙標記單克隆抗體20 μl,另3個試管分別加入CD4+/CD8+、CD4+、CD8+單克隆抗體20 μl,充分混勻,孵育26℃ 15 min后,加入600 ml紅細胞溶解液溶解10 min,以1 200 r/min，離心5 min除去上清,將細胞懸浮在500 μl的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進行流式細胞儀分析。

1.2.5胸腺指數 采用胸腺指數測定，將大鼠胸腺完全剝離，采用電子天平檢測重量，計算胸腺指數，胸腺指數=胸腺質量/體重。

1.2.6CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平檢測 取右肺組織，用PBS沖洗3次，加入細胞裂解液在混勻機下冰浴破碎，于12 000 r/min離心機中4℃離心15 min，收集上清液于-80℃儲存，沸水煮5 min，室內4℃保存。采用ELISA檢測，取50 mmol/L碳酸鹽包緩沖液稀釋抗原加入聚苯乙烯反應孔，加蓋處理。4℃環境內靜置24 h，次日取出洗滌3次拋干，添加對照標本、0.1 ml待檢標本，42℃條件下放置1 h，洗滌拋干，在每孔中加入低物液均勻，加入0.1 ml鄰苯二胺遮光處理20 min，加入1 ml H2SO4，終止反應，經繪制標準曲線計算CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平。

1.2.7Western印跡檢測TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白 取所有大鼠肺組織蛋白，提取50μg蛋白，加入蛋白緩沖液內，提取常規蛋白并使用二喹啉甲酸(BCA)法對其進行定量分析。凝膠電泳、轉膜，取膜，4 ℃下固定、封閉處理1 h，TCF、GSK-3β、β-catenin和內參β-actin蛋白在室內封閉90 min,按1∶1 000加入TCF抗體、GSK-3β抗體、β-catenin抗體、β-actin抗體，以1∶2 000加入c-fos抗體,4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，5 min/次，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為 1 h，TBST連續洗膜3次，5 min/次。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達情況。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1病理組織學觀察 正常組HE染色未發現病變。模型組實變內肉芽腫樣病變形成，鏡下見多核巨細胞多發淋巴細胞浸潤，低劑量組伴大量泡沫細胞和巨噬細胞浸潤；多核巨細胞、類上皮細胞上升，有結核小結形成，中劑量組在實變組織內見散在類上皮細胞形成，多核巨細胞較少，并有結核小結形成趨勢，高劑量組可見肺泡間隔增寬，少量淋巴細胞浸潤，中性粒細胞和巨噬細胞散在分布。見圖1。

圖1 各組肺組織病理觀察(HE染色，×400)

2.2各組CD4+/CD8+、CD4+、CD8+、胸腺指數水平比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數水平明顯低于正常組，CD8+水平明顯高于正常組(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數水平明顯高于模型組，CD8+水平明顯低于模型組(P<0.05)；中劑量組、高劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數水平明顯高于低劑量組，CD8+水平明顯低于低劑量組(P<0.05)；中劑量組CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指數水平明顯低于高劑量組，CD8+水平明顯高于高劑量組(P<0.05)。見表1。

2.3各組CA125、IFN-γ、TGF-β水平比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯高于正常組(P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯低于模型組(P<0.05)；中劑量組、高劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯低于低劑量組(P<0.05)；中劑量組CA125、IFN-γ、TGF-β水平明顯高于高劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組CD4+/CD8+、CD4+、CD8+、胸腺指數、CA125、IFN-γ、TGF-β水平比較

2.4各組肺組織IL-6、TNF-α、IL-10水平比較 相比于正常組，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高(P<0.05)；與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組IL-6、TNF-α水平明顯降低，IL-10水平明顯升高(P<0.05)；與高劑量相比，中劑量組IL-6、TNF-α水平明顯升高，IL-10水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.5各組Wnt/β-catenin信號通路蛋白基因表達比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達均明顯高于正常組(均P<0.05)；低劑量組、中劑量組、高劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達均明顯降低于模型組(均P<0.05)；中劑量組、高劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達均明顯低于低劑量組(均P<0.05)；中劑量組TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達均明顯高于高劑量組(均P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組肺組織IL-6、TNF-α、IL-10水平及Wnt/β-catenin信號通路蛋白基因表達量比較

1～5:正常組，模型組，低劑量組，中劑量組，高劑量組圖2 Western印跡檢測各組細胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白

3 討 論

結核病嚴重的會引起全身器官的病變，其中肺結核是結核病中發病率最高的一種，該病感染率、耐藥率、死亡率均極高，一旦發病，將對患者的生命健康會造成及極嚴重的影響〔7,8〕。本研究提示，肺結核的發病與免疫體功能之間存在著一定的關系，機體免疫功能的降低會導致該病的發生及發展，同時，通過提升患者免疫功能也能較好地改善及抑制病情。

黃芩中提取的成分有漢黃芩苷、黃芩苷、黃芩新素、黃芩素、漢黃芩素等，其中黃芩苷的含量較高并作為藥典中黃芩質量標準的檢測指標。黃芩具有清熱燥濕，瀉火清心、涼血活血的功效，對人體有抗菌、抗病毒、清熱燥濕的功效。抗病毒、抗菌：黃芩對革蘭陰性菌、致病性皮膚真菌、革蘭陽性菌有抑制作用。而且黃芩還能抑制乙型肝炎病毒、流感病毒等；清熱燥濕：可用于濕溫發熱、濕熱瀉痢、濕熱、胸悶、口渴不欲飲等病癥〔9〕。現代藥理學研究顯示，黃芩有解熱作用，在抗菌、抗感染、抗病毒等藥理過程中均有體現。本文研究說明，高劑量岑提取物可有效改善肺結核模型大鼠免疫功能，抑制通路因子的異常表達，調節機體免疫反應，效果顯著。

CD4+屬于T細胞亞群，表達于T細胞受體中，一定程度上能夠反映出機體的免疫功能，參與肺結核的發病〔10〕。同時CD4+還能夠起到激活CD8+的作用，對于細菌的侵襲感染均具有較好的抵抗效果，提升患者的免疫功能，且一定程度上還能消滅肺結核致病菌〔11〕。CD8+T細胞在被CD4+激活后，會參與機體的免疫系統中，參與抗結核病的保護機制中，能夠有效抑制細菌的增殖〔12,13〕。本研究說明高劑量芩提取物對肺結核模型大鼠CD4+/CD8+、CD4+、CD8+水平有一定的調控作用，效果顯著。

CA125是一種高分子量糖蛋白,其在機體眾多細菌性疾病及免疫性疾病中均呈現異常表達〔14，15〕。IFN-γ在機體眾免疫系統中均存在一定的調節作用，能夠增強細胞的免疫功能〔16,17〕。TGF-β是重要的致肺纖維化細胞因子，活化TGF-β因子在肺纖維化細胞間質膠原的合成和分解、增殖和分裂中發揮重要作用〔18〕。IL-6可誘導B細胞分化和抗體產生，在機體免疫應答中起到一定作用〔19〕。TNF-α是巨噬細胞產生的急性炎癥細胞因子〔20〕。IL-10由B細胞、單核巨噬細胞等產生，屬于抑制炎癥反應的細胞因子，在慢性病程中可以抑制細胞介導的免疫應答〔21〕。本文結果說明高劑量岑提取物可有效抑制肺結核模型大鼠CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平，可有效降低炎癥反應，抑炎因子產生，效果顯著。Wnt通過自分泌發揮作用，是分泌型糖蛋白。Wnt信號通路在多種細胞增殖再生、分化、遷移中起著重要的調節作用。研究顯示，Wnt/β-catenin信號通路參與了肺癌和纖維化的發生發展，在肺泡巨噬細胞抗感染中發揮免疫調控作用，其長鏈非編碼RNA是轉錄長度>200 nt的RNA分子，不能直接編碼蛋白質，但能抑制染色質重塑、參與轉錄、轉錄后水平上調控基因表達〔22〕。本研究顯示，高劑量黃芩提取物可有效抑制肺結核模型大鼠Wnt/β-catenin信信號通路蛋白基因表達量，從而控制其大鼠病情發展。

綜上，黃芩提取物通過作用于Wnt/β-catenin信號通路，調控TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表達，可有效改善免疫功能的異常表達及炎癥反應。