HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)冠心病大鼠的干預(yù)及降血脂作用

杜蕊 李娜 趙彩杰 紀(jì)征 (河北唐山工人醫(yī)院心內(nèi)一科，河北 唐山 063000)

冠心病簡(jiǎn)稱為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，是一種缺血性心臟病〔1〕。導(dǎo)致冠心病的危險(xiǎn)原因有很多除了遺傳因素和年齡等不可控制的因素外，還包括超重、糖尿病、吸煙、肥胖、血脂異常、高血壓等可控的因素，對(duì)這些因素進(jìn)行積極防控有助于防治冠心病〔2,3〕。冠心病多發(fā)生在40歲以上成人，并且女性發(fā)病晚于男性，近年來(lái)呈年輕化趨勢(shì)〔4〕。冠心病早期可無(wú)任何癥狀，僅表現(xiàn)為劇烈體育活動(dòng)或者重體力勞動(dòng)后，出現(xiàn)心絞痛癥狀，服用擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈藥物或休息后可迅速緩解〔5〕。冠心病典型癥狀為心絞痛、呼吸短促、胸部壓迫等，發(fā)生急性冠脈綜合征時(shí)，除了典型的心絞痛之外可能還會(huì)伴有突然出現(xiàn)頭暈、惡心、冷汗或消化不良的感覺、活動(dòng)時(shí)頸部疼痛，呼吸短促感覺加劇〔6,7〕。本研究探討羥甲基戊二酰輔酶(HMG-Co)A還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)冠心病模型大鼠的干預(yù)效果及降血脂作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取44只清洗級(jí)SD健康雄性大鼠(成都達(dá)碩生物科技有限公司)，體重180～230 g，平均(204.2±21.3)g，根據(jù)體重隨機(jī)分為分正常組、模型組、阿托伐他汀組、聯(lián)合治療組各11只。在環(huán)境溫度(22±2)℃、濕度(52±2)%條件下進(jìn)行喂養(yǎng)，將飲用水及食物消毒后，自然采光，自由飲食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。主要試劑及使用藥物：維生素D注射劑(上海通用藥業(yè)股份有限公司)；垂體后葉素注射液；兔抗大鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)抗體(Hyclone公司)。

1.2建模及給藥 建模：選取11只大鼠，不進(jìn)行任何處理作為正常組。其余33只進(jìn)行冠心病模型建立。對(duì)大鼠麻醉后將氣管切開插管，采用動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行輔助呼吸，褪去大鼠胸部毛，消毒處理后，沿左鎖骨中線切開大鼠胸腔，剪開心包，輕微按壓右側(cè)胸部擠出心臟。對(duì)左冠狀動(dòng)脈前降支中上部位采取結(jié)扎處理，后將心臟復(fù)位關(guān)胸，于大鼠蘇醒后縫合拔管，Ⅱ?qū)碾妶D檢測(cè)，當(dāng)ST段下移或者T波改變現(xiàn)象視為建模成功。建模過程中死亡1只，最終建模成功32只，分為模型組10只，阿托伐他汀組11只，聯(lián)合治療組11只。

給藥：阿托伐他汀組、聯(lián)合治療組建模成功后第1天分別給予0.10 mg/ml阿托伐他汀溶液、10 mol/L HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合0.10 mg/ml阿托伐他汀溶液。

1.3標(biāo)本采集 在實(shí)驗(yàn)各組分別治療的第1周后，對(duì)所有大鼠禁食不禁水，使用乙醚吸入麻醉，進(jìn)行背部固定，描記Ⅱ?qū)碾妶D，抽取腹部靜脈血10 ml對(duì)血脂、心肌酶等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)后，剖開胸腔，戊二醛固定，剝離心臟及置于載玻片上的心尖組織。將一部分心肌組織置于戊二醛、磷酸緩沖液配制液中進(jìn)行固定，另一部分置于液氮中保存待用。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠心肌組織固定24 h后，將大鼠心肌組織從戊二醛、磷酸緩沖液配制液中取出并且進(jìn)行脫水處理，處理后進(jìn)行石蠟包埋、切片、染色。染色后在顯微鏡下觀察。

1.5脂聯(lián)素(APN)表達(dá)量檢測(cè) 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)APN表達(dá)：提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA純度、含量，逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，內(nèi)參U6。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃ 10 min，40℃ 60 min，85℃ 5 min；設(shè)置擴(kuò)增條件：94℃ 20 s、72℃ 30 s、60℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算出需要檢測(cè)的APN表達(dá)量。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)肌酸激酶(CK)、AST、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平 取主動(dòng)脈血5 ml，使用3 000 r/min離心機(jī)進(jìn)行離心處理15 min，制備血清。使用ELISA法對(duì)CK、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C、TNF-α水平檢測(cè)：將血清置于室溫，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，然后取出試劑盒，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋血清和標(biāo)準(zhǔn)品100 μl/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；然后用專用的洗滌液將反應(yīng)板清洗3次以后，再加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μl/孔，放于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μl/孔終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，顏色反應(yīng)深淺與CK、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C、TNF-α水平成正比，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CK、AST、TC、TG、HDL-C、LDL-C、TNF-α水平。

1.7血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)進(jìn)行檢測(cè)：使用全自動(dòng)生化分析儀時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行，避免出現(xiàn)誤差。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1病理圖 正常組心肌細(xì)胞形態(tài)及間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，未見有炎癥細(xì)胞侵入；模型組心肌橫紋、肌束斷裂消失，細(xì)胞膜不完整，炎癥細(xì)胞滲出，大量結(jié)締組織增生；阿托伐他汀組心肌橫紋、肌束少量斷裂消失，炎癥細(xì)胞較少滲出，少量結(jié)締組織增生；聯(lián)合治療組心肌細(xì)胞形態(tài)及間質(zhì)結(jié)構(gòu)趨于正常，但有少量炎癥細(xì)胞侵入。見圖1。

圖1 各組心肌病理(HE染色,×400)

2.2各組心臟APN、TNF-α、CK及AST表達(dá)量對(duì)比 與正常組相比，模型組APN表達(dá)量明顯下降、TNF-α表達(dá)量明顯上升(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀組APN表達(dá)量明顯上升，TNF-α表達(dá)量明顯下降(P<0.05)；與阿托伐他汀組相比，聯(lián)合治療組APN表達(dá)量明顯上升，TNF-α表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。與正常組比較，模型組CK、AST水平明顯上升(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀組CK、AST水平明顯下降(P<0.05)；與阿托伐他汀組相比，聯(lián)合治療組大鼠CK、AST水平明顯下降(P<0.05)。見表1、表2。

2.3各組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 與正常組相比，模型組血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯上升，紅細(xì)胞變形指數(shù)明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀組血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯下降，紅細(xì)胞變形指數(shù)明顯上升(P<0.05)；與阿托伐他汀組相比，聯(lián)合治療組血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯下降，紅細(xì)胞變形指數(shù)明顯上升(P<0.05)。見表1。

表1 各組APN、TNF-α、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)比較

2.4各組血脂指標(biāo)比較 與正常組相比，模型組TC、TG、LDL-C明顯上升、HDL-C明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀組TC、TG、LDL-C明顯下降，HDL-C明顯上升(P<0.05)；與阿托伐他汀組相比，聯(lián)合治療組TC、TG、LDL-C明顯下降，HDL-C明顯上升(P<0.05)。見表2。

表2 各組CK、AST及TC、TG、LDL-C、HDL-C比較

3 討 論

冠心病臨床表現(xiàn)主要為出現(xiàn)不同程度的心絞痛，對(duì)患者生活及身體健康造成嚴(yán)重影響〔8，9〕。中老年人為冠心病主要發(fā)病人群，近年來(lái)受社會(huì)發(fā)展、飲食習(xí)慣改變、生活方式等影響，心血管疾病發(fā)病率不斷上升，且部分疾病發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)〔10〕。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，高血壓、血脂水平異常等均屬于常見冠心病誘因。HMG-CoA還原酶在臨床可以有效治療心血管疾病，也是膽固醇合成酶系中的關(guān)鍵，他汀類藥物通過對(duì)他的抑制作用從而使肝臟合成膽固醇受到抑制。阿托伐他汀屬于Ⅱ型他汀類藥物，與Ⅰ型他汀類藥物相比具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)〔11,12〕。

由免疫細(xì)胞合成分泌的內(nèi)源性多肽屬于炎癥因子，可以介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)，具有強(qiáng)大生物學(xué)效應(yīng)。目前研究認(rèn)為冠狀動(dòng)脈硬化的發(fā)生與發(fā)展與炎癥反應(yīng)具有重要作用〔13〕。TNF-α作為一種多種生物學(xué)效應(yīng)的初級(jí)炎癥因子，參與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化與TNF-α之間形成密切相關(guān)〔14〕。APN是大鼠脂肪組織中發(fā)現(xiàn)一種膠原樣細(xì)胞因子。心肌細(xì)胞不僅分泌APN,而且存在APN特異性集合受體，是一種新保護(hù)性抗炎細(xì)胞因子，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有抑制作用。通過多種途徑對(duì)心血管保護(hù)作用，維護(hù)心血管正常生理功能〔15〕。本研究結(jié)果說明APN、TNF-α與冠心病有著密切關(guān)系。

臨床上通過對(duì)CK、AST活性變化監(jiān)測(cè)對(duì)心肌損傷程度進(jìn)行評(píng)估。CK、AST等酶在心肌組織細(xì)胞中廣泛存在，對(duì)維持心肌正常生理功能發(fā)揮重要作用。正常情況下，血清CK、AS活性較低，當(dāng)心肌缺血造成代謝紊亂，造成心肌細(xì)胞內(nèi)多種酶釋放進(jìn)入外周血，加重缺血對(duì)心肌損傷〔16,17〕。本研究結(jié)果HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)冠心病模型大鼠進(jìn)行治療，血清CK、AST水平降低，提示有效降低血清CK、AST活力，減輕心肌缺血損傷程度。

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)，而冠心病損傷反應(yīng)學(xué)中脂質(zhì)是必備條件。血清TC、TG、LDL-C升高、HDL-C降低，對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮均可造成損傷，高通透性，加速脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)皮下的沉積，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成，進(jìn)而促進(jìn)冠心病形成〔18〕。研究發(fā)現(xiàn)，血清CK長(zhǎng)期增高，使冠心病發(fā)生概率增加，LDL-C水平越高，患有冠狀動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)越大〔19〕。本研究結(jié)果顯示，通過HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)冠心病模型大鼠進(jìn)行治療，對(duì)脂類代謝具有明顯調(diào)控作用。

血流流變學(xué)對(duì)判斷疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的重要指標(biāo)〔20〕。血液流動(dòng)減慢說明全血黏度增高，紅細(xì)胞變形能力及減低。受血流變慢影響，紅細(xì)胞聚集增多，導(dǎo)致外周血循環(huán)受阻，心臟缺血，無(wú)法得到足夠供養(yǎng)，血液濃縮，加重疾病的發(fā)展。對(duì)血液流變改善，降低血液黏度可有效緩解脂質(zhì)沉積、紅細(xì)胞堆積現(xiàn)象，減輕冠心病臨床癥狀〔21〕。本研究結(jié)果顯示，通過HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)冠心病模型大鼠進(jìn)行治療，對(duì)改善冠心病大鼠血液流變學(xué)效果顯著。

綜上，使用HMG-CoA還原酶抑制劑聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)冠心病模型大鼠進(jìn)行治療，有效抑制炎癥因子、減輕心肌損傷、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝降血脂、改善血液流變學(xué)、對(duì)冠心病大鼠有著一定的治療效果。