miR-339-5p過表達對帶狀皰疹后遺神經痛大鼠疼痛緩解的機制

劉晉如 王平生 邱頤 王偉 王曉東

(1巴彥淖爾市醫(yī)院疼痛科，內蒙古 巴彥淖爾 015000；2內蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院麻醉科；3巴彥淖爾市醫(yī)院麻醉科)

帶狀皰疹后遺神神經痛是皮膚科常見的皮膚性疾病之一，由水痘-帶狀皰疹病毒引起。該疾病會造成患者出現(xiàn)泛紅，發(fā)熱等癥狀，嚴重可能會造成肺炎和腦炎的發(fā)生，危及患者生命〔1〕。對于引起帶狀皰疹的病毒稱之為為嗜神經性，病毒侵入感覺神經末梢后，可沿神經移動至脊髓后根神經節(jié)隱匿〔2〕。如果清除掉體內的病毒和感知周圍神經，將不會出現(xiàn)后遺神經痛這一并發(fā)癥的發(fā)生。帶狀皰疹后遺神經痛為帶狀皰疹較為常見的并發(fā)癥，屬于頑固性神經病理性疼痛疾病，主要癥狀多為自發(fā)痛、誘發(fā)痛、痛覺過敏等，此病病程大多遷延反復，臨床治療難度較大〔3〕。所以，對于帶狀皰疹后遺神經痛的發(fā)生，需要盡快干預，來緩解疾病情況〔4，5〕。本研究探究miR-339-5p過表達對帶狀皰疹后遺神經痛緩解機制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取48只SPF級SD大鼠，雌雄各半〔單位名稱：山東大學，許可證號：SYXK(魯)2020 0022〕，月齡(4.75±0.95)個月，體重(268.38±35.62)g，溫度22～25℃、相對濕度52%的清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)1 w，光照12 h/d。環(huán)境安靜，大鼠可自由飲水、飲食。

主要試劑：miR-339-5p(廣州威佳科技有限公司)，白細胞介素(IL)-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α及5-羥色胺(HT)相關的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司；神經生長因子(NGF)ELISA試劑盒購自南京賽泓瑞生物科技有限公司，同源性磷酸張力蛋白誘導激酶(PINK)1抗體(武益普生物科技有限公司，貨號：ATA35522)，帕金森蛋白(Parkin)抗體(武益普生物科技有限公司，ATA35114)，電子測通儀(上海玉研科學儀器有限公司，型號：2091)。

1.2分組及建模 48只大鼠隨機分為空白組、過表達組、沉默組、模型組各12只，模型組、過表達組、沉默組。參照李晶晶等〔6〕研究實驗帶狀皰疹后遺神經痛大鼠。構建方法：將CV-1細胞添加到杜爾貝克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)/F12中，并培養(yǎng)基制備細胞懸液，根據5.0×104/cm2接種于培養(yǎng)瓶，然后用VZV感染cV-1細胞，當CV-1細胞80%被感染，立刻收集并作細胞懸液接種帶狀皰疹病毒，將SD大鼠放入SPF實驗環(huán)境為中等濕度、溫度中，在造模前，用4%水合氯醛麻醉SD大鼠，在SD大鼠右腳底部皮下注射50 μl病毒接種溶液。感染7 d后如果大鼠出現(xiàn)機械痛敏閾值、熱痛敏閾值降低，為造模成功。

1.3miR-339-5p基因表達量 收集入組所有大鼠的靜脈血3 ml,對其靜脈血進行離心處理，2 000 r/min，離心半徑10 cm，離心8 min。miRNA采用miRVana PARIS試劑盒提取純化。在室溫下加入取出的500 μl血清樣品等體積變性液,混合均勻，加入同樣多的體積酸性酚氯仿,搖晃30～60 s；室溫下14 000 r/min離心5 min。把上清液放到另一個管中，加入1.25倍無水乙醇充分混勻，然后加入柱中，12 000 r/min離心30 s,棄濾液；700 μl加入柱中，清洗1次,12 000 r/min離心30 s，棄濾液；把500 μl加入柱中，清洗2次,12 000 r/min離心1 min；95℃預熱洗脫液60 μl加入柱子中，離心1 min 12 000 r/min,收集miRNA。miR-339-5p序列由miRBase數(shù)據庫查得，miR-339-5p引物：5′-UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACA-3′。RNU6B上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACG CTTCACGAATTTG-3′。qRT-PCR提取DNA 0.5 ml血清加等量的裂解液于尖底離心管中，37℃孵育1 h,加入0.1 ml樣品稀釋液。PCR擴增取上述0.02 ml DNA提取液加入分裝好的反應液管中。

1.4病理觀察 采用猝死老鼠的方法，迅速分離出背部神經節(jié)組織，行病理切片，做常規(guī)脫蠟處理，蘇木素-伊紅(HE)染色，使用顯微鏡觀察大鼠背部神經節(jié)組織病理變化情況。

1.5機械痛閾測定 使用電子測痛儀進行測定，測定時間為早晨8∶00～12∶00。將大鼠放在透明玻璃箱中，箱中底部有金屬網，大鼠在玻璃箱中適應20 min，等大鼠平靜后開始。各組實驗大鼠刺激部位一樣，用電子測痛儀刺激探頭尖端輕輕垂直的刺激大鼠后腳足底，刺激強度逐漸增加，表示電子疼痛儀顯示的強度值(單位：G)。如果大鼠出現(xiàn)舔足、縮足等,記錄電子測痛儀顯示的最大值(單位:g)。5 min/次,重復3次,機械縮足閾值(PMWT)是以3次健側結果的平均值。

1.6IL-2、TNF-α、5-HT、NGF水平檢測 采用ELISA檢測大鼠IL-2、TNF-α、5-HT、NGF，采集所有大鼠血樣本，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min,用移液槍吸取上清液，采用ELISA檢測大鼠IL-2、TNF-α、5-HT、NGF，將IL-2、TNF-α、5-HT、NGF放入微孔中，依次放入標準樣品、標本和辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體中，溫育后清洗干凈。底物是TMB，TMB在酸的作用下成黃色，過氧化物酶的催化下成藍色。酶標儀測定在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。

1.7Western印跡檢測PINK1、Parkin蛋白表達 取相關脊髓組織，采用RIPA裂解液，從相關組織的勻漿內，提取蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白濃度進行測定。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并將其浸泡于脫脂牛奶內，室溫下密封4 h，加入稀釋后的PINK1、Parkin兔單抗，孵育過夜(4℃)，加二抗，室溫下孵育60 min。采用ECL定影，凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。內參蛋白為β-actin，目標蛋白同內參蛋白的比值，作為蛋白的相對表達量。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行F檢驗、t檢驗。

2 結 果

2.1病理觀察 空白組無單核細胞浸潤現(xiàn)象，神經節(jié)細胞形態(tài)結構正常；模型組出現(xiàn)單核細胞浸潤現(xiàn)象，神經節(jié)細胞變性；過表達組存在較輕的單核細胞浸潤現(xiàn)象，神經節(jié)細胞形態(tài)結構基本恢復正常；沉默組出現(xiàn)大量單核細胞浸潤現(xiàn)象，神經節(jié)細胞變性。見圖1。

圖1 各組背部神經節(jié)組織HE染色

2.2各組miR-339-5p基因表達量及不同時間點痛閾值比較 與空白組相比，模型組、過表達組、沉默組miR-339-5p表達均降低，模型組、過表達組、沉默組不同時間點痛閾值明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，過表達組miR-339-5p表達升高，不同時間點痛閾值降低；沉默組miR-339-5p表達降低，不同時間點痛閾值升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。與過表達組相比，沉默組不同時間點痛閾值升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-339-5p基因、不同時間點痛閾值比較

2.3各組SD大鼠血清IL-2、TNF-α、5-HT、NGF、PINK1、Parkin水平比較 與空白組相比,模型組、過表達組、沉默組IL-2、TNF-α 、5-HT、NGF水平明顯升高,PINK1、Parkin表達明顯降低(均P<0.05)。過表達組IL-2、TNF-α 、5-HT、NGF水平明顯明顯低于模型組,PINK1、Parkin明顯高于模型組(均P<0.05)。與模型組相比,沉默組 IL-2、TNF-α、5-HT、NGF水平明顯升高, PINK1、Parkin水平降低(均P<0.05)。與過表達組比較,沉默組IL-2、TNF-α 、5-HT、NGF水平明顯升高,沉默組 PINK1、Parkin 表達明顯降低(均P<0.05)。 見表2、圖2。

表2 各組SD大鼠血清IL-2、TNF-α、疼痛5-HT、NGF、PINK1/Parkin信號通路基因水平比較

圖2 Western印跡檢測各組細胞PINK1/Parkin信號通路蛋白

3 討 論

帶狀皰疹后遺神經痛屬于一種與脊髓、脊髓上中樞、外住神經敏化相關的神經疼痛，該疼痛呈現(xiàn)出陣發(fā)性電擊樣疼痛和針刺樣持續(xù)燒灼痛〔7〕。皰疹治愈后，越有可能出現(xiàn)嚴重的神經疼痛，需要早期干預；注意休息，認真吃藥和擦藥，服藥期間不要吃辛辣食物:如海鮮、雞蛋、魚、牛羊肉及油炸食品，以清淡為主，多吃蔬菜和水果，補充維生素〔8,9〕。老年患者和虛弱病的患者應該避免嚴重并發(fā)癥的發(fā)生:大多數(shù)老年患者由于身體功能下降,免疫功能低下,在帶狀皰疹的相關原因的作用,疾病容易發(fā)生嚴重并發(fā)癥后,對虛弱的人來說,特別是長期使用糖皮質激素的患者一樣,所以預防嚴重并發(fā)癥的發(fā)生是非常重要的〔10,11〕。本研究說明miR-339-5p能夠抑制5-HT、NGF釋放，明顯減少疼痛時間。

miRNA在神經系統(tǒng)中起到重要的作用，在機體內對腦內神經元的分化、神經元退行等過程進行參與，能夠對機體神經元的正常運作產生作用。而miRNA的作用也與神經病毒的感染具有一定關聯(lián)。如HSV-1、HIV等。在細胞凋亡、炎性的過程中，相關神經通過血液中的miRNA進行信號交換〔12〕。miR-339-5p在機體內對于神經元軸突形成突觸這一過程進行參與，并且與神經祖細胞及神經母細胞瘤細胞相比，miR-339-5p自身的表達呈現(xiàn)下調狀態(tài)，由此可得出，miR-339-5p可能對于神經元分化成熟過程進行了參與。miR-339-5p在不同神經病中的表達不同，miR-339-5p表達上調是由于乙醇誘導的大腦炎癥導致的，乙醇可以刺激鼠小膠質細胞和大腦組織中miR-339-5p及炎性因子的表達。miR-339-5p在帶狀皰疹后遺神經痛表達下降，本研究結果表明miR-339-5p可能參與帶狀皰疹后遺神經痛的發(fā)展、發(fā)生。

5-HT存在于血清中，而在動物中存在于動物相關組織內，自身也是屬于一種抑制性神經遞質〔13,14〕。NGF是一種蛋白質，在動物中可以得出，能夠對中樞神經元的生長情況進行調節(jié)，維持神經元的存活〔15〕。IL-2是一種趨化因子家族的細胞因子，它是一種由多細胞來源，具有多向性作用〔16〕。在機體的免疫應答和抗病毒感染中起著重要的作用，對T細胞的增殖能夠產生刺激作用，使其活化T細胞自身活性增強。并且還能夠對NK細胞的增殖產生刺激作用，并對LAK細胞產生誘導作用〔17,18〕。TNF-α是由活化單核細胞、T細胞、巨噬細胞、脂肪細胞、B細胞、成纖維細胞等多種細胞分泌的多向促炎細胞因子〔19〕。本研究說明5-HT、NGF和帶狀皰疹疼痛調制相關性較好，有致痛和鎮(zhèn)痛雙重作用。

PINKI以蛋白酶形態(tài)存在，屬于高保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，自身的存在是由581個氨基酸組成，廣泛在哺乳動物各組織器官中表達,在心臟、骨骼肌、神經系統(tǒng)中含量最高。Parkin是具有465個氨基酸的E3泛素連接酶，根據其氨基酸序列功能，可分為RINGO結構域、RING1結構域、N端泛素樣結構域、RING2結構域、RING1與RING2之間的IBR結構域5個區(qū)域〔20〕。N端泛素樣結構域的功能主要包括結合蛋白酶體、識別細胞基質、結合SH3、Parkin活性、調節(jié)泛素蛋白等。有研究表明PINK1/Parkin信號通路是調節(jié)線粒體自噬的主要途徑之一。炎癥、創(chuàng)傷等其他疾病引起神經損傷后,會導致神經細胞的氧化應激反應,從而導致功能出現(xiàn)損傷和神經病理性疼痛的發(fā)生。靳曉飛等〔21〕研究認為在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中PINK1/Parkin信號通路介導的線粒體自噬起到重要的作用，可能為預防和治療缺血性腦卒中找到新的治療靶點和機制。本研究說明PINK1/Parkin信號通路在應激性疾病發(fā)病機制中起到重要作用，通過過表達PINK1、Parkin達到減少疼痛的效果，在應激狀態(tài)下PINK1/Parkin信號通路受到抑制,PINK1/Parkin水平明顯上升。

綜上，過表達miR-339-5p基因經作用于PINK1/Parkin信號通路后，有效緩解疼痛程度，miR-339-5p可以成為對帶狀皰疹后遺神經痛診斷和病情判斷的分子標志物。