葡萄糖調節蛋白78在原發性肝癌患者癌組織中表達及其與預后的關系

蘇博 錢國武 閆振宇 張森 王晶璇

(南陽市中心醫院 1病理科，河南 南陽 473000；2普通外科)

原發性肝癌(PHC)屬于我國常見的惡性腫瘤，流行病學研究結果顯示，中國肝癌粗發病率為25.9/10萬，是全球肝癌粗發病率的2倍〔1〕。由于PHC早期診斷率低、高侵襲性及放化療不敏感等多種危險因素導致其病死率較高，臨床預后差〔2〕。PHC的發生發展與腫瘤局部微環境有關〔3〕，葡萄糖調節蛋白(GRP)78屬于熱休克家族成員之一，與內質網應激有關〔4〕，參與了乳腺癌〔5〕、食管癌〔6〕等多種腫瘤的發病機制，目前關于PHC組織中GRP78表達水平與預后的相關性尚不清楚，本研究通過采用免疫組化方法檢測PHC組織中GRP78的表達水平，探討其與臨床-病理特征及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月1日至2014年12月31日于南陽市中心醫院普外科和肝膽胰腺外科擇期行肝癌根治術的96例PHC患者(PHC組)和45例腹部外傷患者(對照組)。PHC組男50例，女46例，平均年齡(55.12±6.49)歲；對照組男25例，女20例，平均年齡(57.10±5.23)歲。兩組性別和年齡比較無顯著差異(P>0.05)。PHC患者納入標準：①年齡≥18歲；②腫瘤組織完整切除，即術后影像學證實無惡性組織殘留，手術切緣周圍均陰性，術后組織病理學證實為PHC；③術前和術后均未進行放療、化療及生物制劑治療等；④臨床資料完整及配合隨訪。排除標準：①合并嚴重心功能不全、腎功能不全、心臟病及其他惡性腫瘤；②合并嚴重黃疸、腹腔積液、門靜脈主干栓塞、凝血功能障礙等。所有患者術后每3個月進行復診1次，必要時進行影像學檢查，生存期為手術后第1日計算，終止日期為患者死亡日期或末次隨訪日期，本研究中末次隨訪截止日期為2019年12月31日，總生存時間定義為手術后至死亡或最后隨訪時間。另選取3例PHC患者手術后新鮮癌組織和癌旁組織及3例腹部外傷行肝臟探查術患者的正常肝臟組織，對癌組織、癌旁組織及正常組織中GRP78蛋白的表達水平的差異進行Western印跡檢驗，3例PHC患者納入和排除標準同上述。所有研究對象知情同意且簽署知情同意協議書，本研究經過醫院倫理委員會批準同意(LCLL-20130516)。

1.2實驗方法

1.2.1試劑 兔源性GRP78單克隆抗體購買于萬類生物科技有限公司(沈陽，中國)。免疫組化(SP)染色試劑盒及二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG〕購買于上海碧云天生物試劑有限公司(上海，中國)。

1.2.2SP SP法進行SP染色，取南陽市中心醫院病理科石蠟包埋的切片，連續切片后制成4 μm厚度切片，常規進行脫蠟和水化，檸檬酸鈉緩沖液加熱進行抗原修復，3%過氧化氫溶液室溫孵育15 min用于阻斷內源性過氧化物酶，再次采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min。10%山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗后4℃孵育過夜，復溫后PBS洗滌3次，每次3 min，滴加二抗室溫孵育30 min。切片用DAB顯色，蘇木精復染。切片沖洗干燥后中性樹膠封片。以已知陽性反應片作為陽性對照，以PBS作為一抗用于陰性對照。免疫組化結果按照如下判定：GRP78抗原陽性反應為細胞質和胞膜中出現黃色顆粒，與背景對比，無色、淺黃色、棕黃色和棕褐色分別得0、1、2、3分；陽性細胞數得分：隨機采集10個代表性的視野計算陽性表達率，陽性表達率為陽性細胞數/腫瘤細胞總數×100%，陽性表達率小于5%(-)、5%～25%(+)、26%～50%()及50%以上()分別得分0、1、2、3分。染色強度得分×陽性細胞數得分為0～1分、2～3分、4～5分和≥6分時分別計為陰性(-)、弱陽性(+)、中度陽性()和強陽性()，本研究中將“～”視為高表達，將“-～+”視為低表達。比較PHC組和對照組GRP78表達水平的差異。

1.2.3Western印跡實驗 取癌組織、癌旁組織及正常肝臟組織分別置于消毒后的研缽中，一邊加入液氮一邊研磨成粉末，收集所有粉末移入EP管，加入500 μl RIPA裂解液，冰上孵育約30 min后離心，吸管吸取上清液于-80℃冰箱中保存。取5 μl蛋白樣品進行電泳、電轉、牛奶封閉，加入一抗GRP78抗體(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)并4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(1∶1 000)孵育1 h。每個條帶的蛋白灰度值采用Image J軟件檢測。組織中GRP78蛋白相對表達水平=GRP78灰度值/β-actin灰度值，重復測量3次，取平均值。

1.2.4臨床資料收集 通過住院病歷系統收集96例患者性別、年齡、HBsAg、肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤數目、腫瘤細胞分化程度、術前AFP水平、微血管侵犯、美國癌癥聯合委員會(AJCC)分期等。

1.3統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t、χ2檢驗，方差分析，SNK-q檢驗，Cox風險比例模型分析，Kaplan-Meier生存分析。

2 結 果

2.1GRP78在PHC患者癌組織中的表達和分布 PHC組GRP78高表達73例，低表達23例；對照組GRP78高表達9例，低表達36例。與對照組比較，PHC組GRP78高表達率顯著升高(χ2=39.542，P<0.001)。在PHC組中，GRP78蛋白陽性信號為黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，位于細胞質和胞膜中。見圖1。

圖1 PHC患者肝癌組織免疫組化染色結果(×200)

2.2PHC患者癌組織中GRP78表達水平和臨床-病理特征的關系 PHC患者癌組織中GRP78表達水平與腫瘤直徑、腫瘤細胞分化程度、微血管侵犯和AJCC分期顯著相關(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 PHC患者癌組織中GRP78表達水平與臨床-病理特征的關系(n)

2.3PHC患者癌組織中GRP78蛋白的表達水平 PHC患者癌組織和癌旁組織及正常肝臟組織中GRP78蛋白表達水平分別為1.39±0.45、0.87±0.14和0.26±0.03，3組相比存在顯著差異(F=10.726，P=0.010)。與正常肝臟組織比較，PHC患者癌組織和癌旁組織中GRP78蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與癌旁組織相比，PHC患者癌組織中GRP78蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 PHC患者癌組織和癌旁組織及組正常肝臟組織中GRP78蛋白表達水平的比較

2.4Cox回歸分析 截止到隨訪時間，本研究中PHC患者死亡39例，生存57例。Cox回歸分析結果顯示，PHC患者5年生存狀態與腫瘤直徑、腫瘤細胞分化程度、微血管侵犯、AJCC分期和GRP78表達水平有關(P<0.05)，其中微血管侵犯、AJCC分期和GRP78表達水平是影響PHC患者預后的危險因素(P<0.001)，見表2。

表2 PHC患者生存的單因素和多因素分析

2.5PHC患者癌組織中GRP78的表達水平與5年生存率的關系 GRP78高表達組5年生存率顯著低于GRP78低表達組(Log-Rank=4.951，P=0.026)。見圖3。

圖3 PHC患者Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

2018年，肝癌發病率位于全球癌癥發病率第6位，死亡率位于第4位〔1〕，多數患者在確診時已經發生轉移，臨床預后較差，故而深入探討PHC分子生物學發病機制對提高患者預后尤其重要。內質網是蛋白合成及分泌的重要場所之一，對調節細胞信號轉導及蛋白生理功能具有顯著的作用，機體肝細胞是含有內質網數量最多的體細胞，內質網應激(ERS)是指由于多種原因如炎癥、缺氧、鈣離子代謝紊亂等從而導致蛋白質折疊、分泌、降解等生理功能的紊亂〔7，8〕，近年來研究認為ERS在肝癌的發病機制中扮演了重要作用〔9，10〕。GRP78屬于內質網分子伴侶，主要參與調控蛋白質正常的生理功能，GRP78也被認為屬于ESR的標志蛋白之一，GRP78能促進腫瘤細胞的快速增長并抑制其凋亡，與腫瘤細胞的耐藥也密切相關〔11，12〕。

本課題組采用免疫組化方法發現PHC患者肝臟癌組織中GRP78表達水平顯著升高，進一步通過Western印跡法證實，GRP78蛋白在正常肝臟組織、PHC患者癌旁組織和PHC患者癌組織中表達同樣呈現逐漸升高趨勢，而既往研究也均證實PHC患者肝癌組織中GRP78表達水平顯著升高〔13，14〕，這與本研究結果基本一致；另外，PHC患者腫瘤體積越大，腫瘤細胞分化程度越低、存在微血管侵犯及AJCC分期越高，GRP78表達水平相對升高，本研究提示GRP78可能與PHC的發生發展及局部侵襲、轉移等有關。Ying等〔14〕通過蛋白組學結果發現肝癌患者術后1個月復發患者血清中GRP78自身抗體表達水平顯著高于未復發患者，且GRP78自身抗體表達水平與臨床分期、門靜脈侵犯及轉移顯著相關。在發病機制上，王月等〔11〕發現GRP78可以通過癌細胞表面的表皮生長因子受體結合，從而促進腫瘤的局部侵襲和轉移，并降低肝癌細胞對索拉菲尼的敏感性；此外，GRP78也可抑制棕櫚酸誘導的肝癌細胞SMMC-7721凋亡過程〔12〕。Luo等〔15〕研究認為，GRP78促進肝癌細胞的增殖可能與活化NF-κB信號通路及上調泛素樣蛋白FAT10表達有關。本研究結果提示，PHC患者肝癌組織中GRP78表達水平與預后密切相關。

綜上，PHC患者肝癌組織中GRP78表達水平顯著上調，GRP78在PHC的發生和發展及腫瘤耐藥和免疫逃逸等多方面均起至關重要的作用，當下調GRP78表達后可能會有效抑制腫瘤的生長，在未來靶向阻斷GRP78的表達也為肝癌的治療提供新的見解與思路〔16〕，但仍需更多的基礎與臨床研究進一步證實。