化瘀解毒方含藥血清對人肺癌A549細胞凋亡的作用及機制

魏征 張俊萍

(1河南省中醫藥研究院，河南 鄭州 450004；2河南中醫藥大學第一附屬醫院；3河南中醫藥大學)

肺癌是全世界范圍內死亡率最高的癌癥，在癌癥死亡人數統計中占比24%，最新數據表明其5年生存率只有19%〔1〕。2019年中國腫瘤的統計數據顯示，中國肺癌新發病例78.1萬例，死亡病例為62.6萬，占癌癥死亡人數的27.2%〔2〕。手術、放療、化療是治療肺癌的主要方法，50%以上肺癌患者確診時已屬晚期，失去了手術機會，放化療便成為晚期非小細胞肺癌(NSCLC)的主要治療手段。近年來，靶向藥物的出現給NSCLC帶來新的希望，但療效有限〔3〕。因此，近年來肺癌的治療更強調綜合治療，而中醫藥因其在臨床治療中的獨到作用引起了醫學界的矚目。大量研究表明，中醫藥在肺癌術后改善患者生存質量、降低復發轉移率、延長生存期和調節免疫功能等方面均具有一定的優勢〔4〕。

中醫辨證論治的最基本原則是“治病必求于本”，并針對病因進行治療，肺癌是以“瘀毒”為基本病機〔5〕，以此為依據確立了活血化瘀，解毒攻毒為中晚期肺癌的重要治法〔6〕。化瘀解毒方是我們醫院常用方，化瘀解毒方所含中藥均證實了臨床治療癥瘕痞塊積證，方中用搜剔破瘀之力較強的蟲類藥，以達到破瘀血、消積塊的目的。前期實驗也已經證明，化瘀解毒方能有效抑制胃癌、肺癌等多種細胞的增殖、侵襲和轉移〔7，8〕，同時動物實驗也給出了相同的實驗結果〔9〕。通過促凋亡是殺死腫瘤細胞的主要途徑之一，化瘀解毒方的含藥血清(HJRMS)能否具有促肺癌凋亡的作用，其機制是什么尚不清楚。因此，探明HJRMS對于肺癌細胞的凋亡作用及其中的分子機制，對于尋找和開發新的抗腫瘤中藥意義重大。本實驗對HJRMS在肺癌細胞凋亡過程中的作用和作用機制進行研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品 為了保證試驗藥效的一致性，藥物來源使用配方顆粒劑，確保指紋圖譜的一致性。化瘀解毒方配伍為全蝎3 g，天龍3 g，三七粉3 g，半枝蓮15 g，廣木香3 g。將配方顆粒劑全蝎、天龍、三七粉、半枝蓮和廣木香(廣東一方制藥有限公司購買)換算成等效生藥量進行配伍。

1.1.2細胞和試劑 人肺癌細胞株A549 ( 中國科學院上海細胞庫)；RPMI1640培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；胰蛋白酶購自上海碧云天公司；MTT粉劑購自Sigma-Aldrich；Bcl-2、Bad和Caspase-3單克隆抗體購自 Cell Signaling Technology 公司；β-actin和HRP標記的羊抗兔IgG 購自Invitrogen公司；Annexin V-FITC試劑盒購自美天旎公司。

1.1.3儀器設備 多功能酶標儀(美國 PE 公司)；二氧化碳恒溫細胞培養箱(美國Thermo公司)；小型垂直電泳槽和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)成像分析儀(美國 Bio-Rad公司)；多通道流式細胞儀(美國 BD公司)；實時熒光定量PCR儀(瑞士 Roch公司)。

1.2細胞培養 人肺癌A549細胞系購買自中國科學院上海細胞庫。肺癌細胞培養在含有10%FBS的RPMI1640培養基中，培養箱設置CO2含量為5%，溫度為 37℃。正常培養及傳代，細胞長滿80%時進行實驗。

1.3含藥血清的制備 取SPF級大耳白兔9 只，實驗前禁食12 h，根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算出大耳兔的灌胃劑量，取6只給予化瘀解毒方藥30 g/(d·kg)劑量灌胃。對照組3只給予相同劑量的生理鹽水，1次/d，連灌1 w。于末次用藥后1 h，無菌條件下心臟采血，分離血清(其中包括含藥血清和對應的對照血清)，56℃、30 min下補體滅活，-20℃冰箱保存備用。

1.4細胞活力檢測實驗 人肺癌A549 細胞，重懸成單細胞懸液濃度為3×104個/ml，均勻地接種于96 孔培養板中使每孔細胞數在3 000個左右。孵育過夜，用含有不同濃度HJRMS的培養基(1%，2%，4%，8%，16%，32%)處理，其余孔加含有對照組血清的RPMI1640培養基，繼續分別孵育24，48 h。然后，向每個孔中添加20 μl 5%的MTT，并在37℃下孵育4 h。棄上清，每孔加入DMSO 150 μl。全自動酶標儀中速振蕩10 min，充分溶解結晶物。490 nm波長，測定每孔的吸光度(A)值。計算細胞生長抑制率公式：抑制率=(1-藥物組A/空白對照組A)×100%。并計算出半數抑制濃度(IC50)，確定低劑量組(含2%HJRMS)、中劑量組(含4%HJRMS)、高劑量組(含8%HJRMS)和對照組(含8%對照組無藥血清)用于后期研究(低劑量組和中劑量組分別補充不含藥血清6%和4%使最終每組的血清總含量一致，下同)。

1.5流式細胞技術 Annexin V-FITC試劑盒用于檢測凋亡細胞和死亡細胞。與磷脂酰絲氨酸(PS)結合的Annexin V-FITC對凋亡細胞呈陽性染色，而碘化丙啶(PI)呈陰性染色。分別處理24 h后，將細胞重新懸浮在100 μl 1×結合緩沖液中，數量為106細胞。然后，將10 μl Annexin V-FITC添加到含有106細胞的每根試管中，并將混合物在室溫下在黑暗中再培養15 min。然后在使用流式細胞儀進行分析之前立即將PI添加到混合物中，樣品上機進行檢測。

1.6Western印跡檢測 正常培養細胞，后將A549肺癌細胞均勻接種于6孔培養皿中，分別提取每組處理過的細胞總蛋白質，然后用SDS-PAGE在120 V的恒定電壓下分離90 min。然后，將蛋白質電轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，分別用抗體(Bcl-2、Bad、Caspase-3和β-actin)進行敷育后，用對應的二抗進行敷育，最后用凝膠成像分析系統(Bio-Rad)檢測蛋白質條帶。

1.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 正常培養人肺癌A549細胞，消化細胞均勻地接種于6孔板中，孵育12 h后。繼續孵育24 h，提取總RNA。Bcl-2、Bad和β-actin 引物由上海生工合成，Bcl-2：正義鏈5′- TTGCCAGCCGGAACCTATG-3′，反義鏈5′- CGAAGGCGACCAGCAATGATA-3′，擴增長度為88 bp。Bad：正義鏈5′- CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG-3′，反義鏈5′- CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3′，擴增長度為249 bp。β-actin：正義鏈5′- CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反義鏈5′- CTCCTTAATGTCACGCACG-AT-3′，擴增長度為250 bp。Bcl-2的反應條件：預變性溫度 95℃ 6 min; 解鏈溫度95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；擴增溫度 95℃ 10 s，62℃ 10 s，72℃ 10 s進行40 個循環。Bad的反應條件：預變性溫度 95℃ 6 min; 解鏈溫度95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；擴增溫度95℃ 10 s，62℃ 10 s，72℃ 10 s進行40 個循環。β-actin的反應條件：預變性溫度 95℃ 6 min; 解鏈溫度95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s；擴增溫度 95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s進行40個循環。最終用獲得的CT值并計算2-ΔΔCt值進行計算分析。用重復測量的每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環數即平均 Ct 值，用于目標基因表達的檢測，以2-ΔΔCt表示 mRNA 的相對表達量。目標基因△Ct=目標基因 Ct 值-同一樣本內參基因 Ct 值。目標基因的相對循環數(△△Ct 值)=處理組的目標基因△Ct 平均值-對照組的目標基因△Ct 平均值。對照組表達量標準化為 1，取 3次實驗均數并繪制相對 mRNA 表達量圖。

1.8統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1HJRMS對肺癌A549細胞增殖活力的影響 對照組的A549細胞生長狀態良好；與對照組相比較，HJRMS組A549細胞的增殖明顯降低了，隨著HJRMS濃度的增加，A549細胞增殖被抑制的現象越明顯，并呈一定的濃度依賴性。見表1。說明HJRMS對于肺癌A549細胞具有明顯的增殖抑制作用，計算出HJRMS對A549細胞的24 h的IC50=15.73。

表1 HJRMS對肺癌A549細胞增殖的影響

2.2HJRMS對肺癌A549細胞凋亡的影響 HJRMS可以明顯促進肺癌A549 細胞的凋亡，無論是早期凋亡還是晚期凋亡。隨著濃度增高，凋亡的細胞數也隨之增加，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3HJRMS對肺癌A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響 HJRMS作用于肺癌A549 細胞后，抑制細胞凋亡相關蛋白Bcl-2表達明顯降低，而促進細胞凋亡蛋白Bad和Caspase-3表達顯著增高，與對照組

比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 HJRMS對肺癌A549 細胞凋亡相關蛋白的影響

2.4HJRMS對肺癌A549細胞凋亡相關蛋白mRNA的影響 與對照組比較，低、中、高劑量組肺癌細胞中Bad mRNA表達水平明顯增高(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 HJRMS對肺癌A549細胞凋亡及相關蛋白的影響和HJRMS作用于A549 肺癌細胞24 h后、Bcl-2和Bad的蛋白和mRNA表達水平

3 討 論

一種理想的抗癌藥物應該能夠引起癌細胞的程序性死亡，從而不傷及正常細胞。近年來，中醫藥已成為抗腫瘤藥物研究的熱點和候選物質的來源。本研究發現，HJRMS對A549細胞的增殖有明顯的抑制作用。此外，流式細胞術的結果還提示HJRMS可增加A549細胞的凋亡，無論是早期還是晚期凋亡。也就是說，HJRMS可誘導肺癌細胞凋亡，從而抑制細胞數量的增加。本文結果表明，HJRMS明顯抑制細胞增殖活力。HJRMS能顯著促進肺癌細胞的凋亡。隨著HJRMS濃度的增加凋亡細胞數明顯增加。這些定量分析結果表明，HJRMS的抗腫瘤作用主要是通過促進細胞凋亡從而抑制細胞增殖來實現的。線粒體途徑的凋亡指標，線粒體膜電位的變化主要受Bcl-2家族蛋白的調控〔10～12〕。Bcl-2家族包括抑制細胞凋亡的Bcl-2和Bad、Caspase-3等誘導細胞凋亡的蛋白〔13〕。Bcl-2水平的降低導致線粒體膜通透性和細胞色素c釋放的改變，從而允許凋亡復合物的形成并激活Caspase家族的蛋白質〔14〕。Caspase-3的激活觸發了細胞凋亡的最終過程〔15〕。Western印跡分析顯示HJRMS可以抑制Bcl-2蛋白表達，上調Bad和Caspase-3蛋白表達，促進細胞凋亡。本研究提示，HJRMS通過調控Bcl-2和Bad的mRNA表達水平，直接影響相應蛋白的表達。這些數據共同表明HJRMS可能是通過影響Bcl-2和Bad的mRNA水平，影響了Bcl-2和Bad蛋白的表達，激活了線粒體介導的凋亡途徑促進了Caspase-3的激活，從而促進肺癌A549細胞的凋亡。這一結論與MTT實驗和流式細胞術實驗結果完全一致。

綜上，HJRMS通過降低Bcl-2的表達，上調Bad和caspase-3的表達，在體外具有明顯的凋亡誘導作用。HJRMS是一種具有明顯抗腫瘤作用的中藥復方血清，有望成為治療肺癌的一種潛在的抗腫瘤藥物。