LncRNA MCF2L-AS1靶向調控miR-138-5p對人骨髓間充質干細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響

徐梅玲 張育珠 申大年

(1青海省第五人民醫院疼痛科，青海 西寧 810007；2西寧市第一人民醫院疼痛科；3青海省第五人民醫院泌尿科)

骨質疏松(OP)以骨量減少、骨組織結構改變為特征，隨著社會老齡化的發展，患有OP病例逐漸升高，加重了患者家人及社會的負擔〔1〕。成骨細胞是骨重建中維持骨量的主要細胞之一，是骨形成過程中的重要功能細胞，其來源于骨髓間充質干細胞(BMSCs)分化失衡是引發OP的關鍵〔2,3〕。研究表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)廣泛參與BMSCs成骨分化進程，調節干細胞及成骨細胞的增殖與凋亡，在干細胞的多能分化及骨科相關疾病的發生發展起重要的調控作用〔4〕。MCF2L可增加滑膜成纖維細胞凋亡及誘導炎癥反應從而促進骨關節炎的發生〔5〕。MCF2L的反義RNA1(MCF2L-AS1)是一種lncRNA，研究報道MCF2L-AS1通過使miR-33a海綿化而積極調節Runx2的表達，可促進BMSCs的成骨分化〔6〕。但MCF2L-AS1對BMSCs分子機制尚不清楚。研究顯示，MSCs誘導分化為汗腺樣細胞過程中has-miR-138-5p減少〔7〕。高脂環境下BMSCs向成骨細胞分化減少，miR-138-5p參與調控高脂環境下骨代謝和成骨細胞的生物學活性〔8〕。本實驗旨在研究MCF2L-AS1可能通過靶向調控miR-138-5p對BMSCs增殖、凋亡和成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1組織來源 收集手術切除的正常骨組織和OP患者的疏松骨組織各25例。所選病例資料完整，無代謝性相關疾病病史及慢性用藥史。

1.2細胞與主要藥品 hBMSCs購自廣州賽萊拉干細胞科技公司；成骨分化培養基購自德國PromoCell公司；人BMSCs(hBMSCs)完全培養基購自武漢益普生物；熒光定量試劑盒購自日本Takara公司；蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自北京百奧萊博；CCK-8、凋亡試劑盒、雙熒光素酶報告基因試劑盒購自北京索萊寶。

1.3細胞培養 將hBMSCs接種于hBMSCs完全培養基中，在37℃水浴中進行復蘇；取對數生長期hBMSCs，將其接種于成骨分化培養基中在37℃、5%CO2培養箱中培養，隔天換液1次，分別收集第0、1、3、7、14天培養細胞備用。

1.4細胞轉染與分組 將si-NC、si-MCF2L-AS1、miR-NC、miR-138-5p、pcDNA-NC、pcDNA-MCF2L-AS1轉染至hBMSCs中，記為si-MCF2L-AS1組、si-NC組、miR-138-5p組、miR-NC組、pcDNA-MCF2L-AS1組、pcDNA-NC組；將si-MCF2L-AS1分別與anti-miR-NC、anti-miR-138-5p共轉染，記為si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組和si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p組。

1.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測LncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p、ALP、RUNX2、OCN表達水平 提取正常骨組織、OP患者骨組織、誘導分化0、1、3、7、14 d的hBMSCs及各組細胞的總RNA，合成cDNA，按熒光定量試劑盒進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。以GAPDH和U6為作為內參，MCF2L-AS1上游引物：5′-TCCAGCTCGTGTCTATG-CAG-3′，下游：5′-CTGCTTCTGCCTCAG-CTTCT-3′；miR-138-5p上游引物：5′-TGCGGAGCTGGTGTTGTGAATC-3′，下游：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；ALP上游引物：5′-GCCATTGGCACCTGCCTTAC-3′，下游：5′-AGCTCCAGGCATATTTCAGTGTC-3′；RunX2上游引物：5′-CCGGTCTCCTTCCAGGAT-3′，下游：5′-GGGAACTGCTGTGGCTTC-3′；OCN上游引物：5′-ACCCTCTCTCTGCTCACTCTGCT-3′，下游：5′-GCTGGGGCTCCAAGTCCATT-3′。

1.6Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、裂解半胱天冬酶(Cleaved-caspase)-3蛋白表達 提取細胞總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜、封閉后，加一抗4℃孵育過夜，加二抗室溫孵育90 min，顯影、成像，檢測蛋白條帶的灰度值。

1.7CCK-8檢測細胞增殖率 細胞培養48 h，每孔加10 μl CCK-8試劑，孵育2 h，酶標儀檢測490 nm處吸光度值(A)。

1.8流式細胞術檢測細胞凋亡率 細胞培養48 h，加膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)混勻，避光孵育10 min；流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.9熒光素酶報告實驗檢測LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的靶向關系 構建含有miR-138-5p結合位點的LncRNA MCF2L-AS1野生型及突變型報告基因載體，hBMSCs細胞轉染miR-NC、miR-138-5p和LncRNA MCF2L-AS1野生型及突變型載體，按說明書檢測熒光素酶活性。

1.10統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p在OP的表達水平 OP骨組織中LncRNA MCF2L-AS1表達水平明顯低于正常骨組織，miR-138-5p表達水平明顯高于正常骨組織(均P<0.001)，見表1。

表1 OP患者中LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的表達水平

2.2在hBMSCs分化培養中LncRNA MCF2L-AS1和miR-138-5p的表達水平 與0 d相比，在hBMSCs分化培養1、3、7、14 d時LncRNA MCF2L-AS1表達、ALP、RUNX2、OCN表達水平明顯升高，miR-138-5p表達水平明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 在hBMSCs分化培養中LncRNA MCF2L-AS1、miR-138-5p及成骨分化相關因子的表達水平

2.3低表達LncRNA MCF2L-AS1對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響 與si-NC組相比，si-MCF2L-AS1組Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率明顯升高，LncRNA MCF2L-AS1表達、ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表達水平、細胞增殖率明顯降低(P<0.05)，見圖1、圖2、表3。

圖1 低表達LncRNA MCF2L-AS1對hBMSCs細胞凋亡的影響

圖2 Western印跡檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表3 低表達LncRNA MCF2L-AS1對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響

2.4高表達miR-138-5p對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響 與miR-NC組相比，miR-138-5p組miR-138-5p表達水平、Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率明顯升高，ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表達水平、細胞增殖率明顯降低(P<0.05)，見表4、圖3。

表4 高表達miR-138-5p對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響

圖3 高表達miR-138-5p對hBMSCs細胞增殖、凋亡相關蛋白的影響

2.5LncRNA MCF2L-AS1靶向miR-138-5p 圖4顯示MCF2L-AS1與miR-138-5p存在結合位點。與miR-NC組比較，miR-138-5p降低WT熒光素酶活性(P<0.001)；對MUT熒光素酶活性無顯著差異，見表5。pcDNA-MCF2L-AS1組miR-138-5p表達水平(0.43±0.04)明顯低于pcDNA-NC組(1.00±0.08，P<0.05)，si-MCF2L-AS1組miR-138-5p表達水平(1.73±0.11)明顯高于si-NC組(0.98±0.09，P<0.05)。

表5 雙熒光素報告實驗

圖4 miR-138-5p和LncRNA MCF2L-AS1結合位點

2.6低表達miR-138-5p部分逆轉MCF2L-AS1低表達對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響 si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p組miR-138-5p表達水平、Cleaved-caspase-3表達水平、細胞凋亡率明顯低于si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組，ALP、RUNX2、OCN、CyclinD1表達水平、細胞增殖率明顯高于si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組(P<0.05)，見表6、圖5。

表6 低表達miR-138-5p 可以部分逆轉MCF2L-AS1低表達對hBMSCs細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響

1～2：si-MCF2L-AS1+anti-miR-NC組，si-MCF2L-AS1+anti-miR-138-5p組圖5 低表達miR-138-5p 和MCF2L-AS1對hBMSCs細胞增殖、凋亡相關蛋白的表達

3 討 論

OP患者BMSCs成骨分化能力減弱，因此增強BMSCs的成骨分化能力及促進BMSCs增殖、抑制凋亡是防治OP的重要途徑之一〔9〕。研究報道LncRNA影響BMSCs的成骨分化進而影響骨代謝進程〔10〕。且已有研究表明LncRNA MCF2L-AS1參與BMSCs的成骨分化〔6〕。本研究結果表明，LncRNA MCF2L-AS1的確參與了BMSCs的成骨分化過程，且與OP的發生發展可能有關。本實驗顯示，ALP、RunX2、OCN表達水平降低，細胞增殖率降低，細胞凋亡率升高。

ALP、RUNX2、OCN均是成骨分化相關因子，ALP是骨組織分解代謝的一種酶，與鈣化有關，可反映成骨細胞分化及功能狀態〔11〕。RUNX2是成骨細胞分化及骨形成的重要轉錄因子，RUNX2能調控間質細胞向前成骨細胞分化〔12〕。OCN由成熟骨細胞分泌，是骨細胞成熟標志〔13〕。本實驗結果表明，低表達LncRNA MCF2L-AS1可抑制hBMSCs增殖促進細胞、凋亡及抑制成骨分化。

研究報道在力學去負荷條件下miR-138-5p表達水平明顯升高，成骨細胞分化能力降低；而 抑制miR-138-5p能有效地逆轉力學去負荷對成骨細胞分化的抑制作用〔14〕。非病毒寡核苷酸抗miR-138傳遞至間充質干細胞可顯著增強BMSC片的體外成骨分化，上調成骨相關基因RUNX2、ALP、OCN和骨形態發生蛋白(BMP)2表達〔15〕。miR-138可抑制人去分化軟骨細胞的成骨分化和礦化作用〔16〕，表明miR-138-5p參與成骨分化。本實驗結果與上述研究結果相符。還有研究報道LOC103691336競爭結合miR-138-5p從而上調BMPR2的表達促進鎂介導的成骨分化〔17〕。本實驗提示，MCF2L-AS1可能通過調控miR-138-5p影響hBMSCs增殖、凋亡和成骨分化。

綜上，低表達LncRNA MCF2L-AS1通過調控miR-138-5p抑制hBMSCs增殖和成骨分化，促進細胞凋亡。低表達LncRNA MCF2L-AS1可能抑制hBMSCs成骨分化影響OP的發展。