畢節市不同地方引種油用牡丹根部丹皮酚 芍藥苷含量測定*

汪青筑 黎代余 劉洪明

油用牡丹是毛茛科、芍藥屬植物，多年生落葉小灌木。油用牡丹具有較高結實率，主要是采收油用牡丹種子、提取油料為目的而種植的牡丹品種或資源類型[1]。具有植株高大、花色艷麗、抗旱耐寒、少病蟲害、結實能力強等優良特性; 中國在實際生產中牡丹品種主要有鳳丹和紫斑 2個品種[2,3]。油用牡丹是在藥用牡丹(鳳丹) 基礎上發展起來的木本油料植物，定植后50年不換茬，堪稱“鐵桿莊稼”[4]。同時比其他品種牡丹具有更高的經濟價值和景觀生態價值，在改善生態環境、增加農民收益、對接精準扶貧政策等具有重要意義[5,6]。

畢節位于貴州省西北部，地處川、滇、黔3省結合部，北亞熱帶濕潤季風氣候，平均氣溫13.20 ℃，年降雨量1100 mm左右。氣候及地理條件都非常適宜油用牡丹的生長[7]。目前，在畢節地區引種和推廣的油用牡丹主要以“鳳丹”品種為主。

本實驗旨在研究油用牡丹的根部(牡丹皮)的成分含量測定，提高油用牡丹的利用范圍和增加其經濟價值。牡丹皮具有清熱涼血，活血化瘀的功效。用于熱入營血，溫毒發斑，吐血衄血，夜熱早涼，無汗骨蒸，經閉痛經，跌撲傷痛，癰腫瘡毒[8]。牡丹皮中主要含有丹皮酚類和芍藥苷類成分[9]。目前用于丹皮酚化學成分的測定方法主要有高效液相色譜法[10]、紫外分光光度法[11]、氣相色譜法[12]、薄層掃描法[13]等。本實驗主要采用高效液相色譜法對畢節市不同地方引種油用牡丹進行含量測定，該測定方法準確可靠，重復性好。

在此基礎上選定黔西縣杜鵑街道大興社區、赫章縣六曲河鎮、威寧縣白馬村、畢節市楊家灣、金沙縣茶園鎮石鐘村、百里杜鵑管理區、織金縣官寨鄉、大方縣雨沖鄉8個地方的引種牡丹進行丹皮酚和芍藥苷的含量測定，對促進畢節實驗區中藥材產業發展，鄉村振興意義重大。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 牡丹藥材采自黔西縣杜鵑街道大興社區、赫章縣六曲河鎮、威寧縣白馬村、畢節市楊家灣、金沙縣茶園鎮石鐘村、百里杜鵑管理區、織金縣官寨鄉、大方縣雨沖鄉8個地方，經鑒定為毛茛科植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)的根及根皮。見表1。

表1 牡丹藥材

1.1.2 儀器與設備賽默飛UItiMate 3000 XRS 型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm，美國安捷倫公司)；OHAUS CORPORTION 電子分析天平(十萬分之一，美國OHAUS公司)；超聲機(上海冠特超聲儀有限公司)

1.1.3 試劑丹皮酚對照品(批號：110708-201407，中國食品藥品檢定研究所)；芍藥苷對照品(批號：110736-201842，中國食品藥品檢定研究所)；乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；甲醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 丹皮酚含量測定溶液制備：對照品溶液制備 取丹皮酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含20 μg的溶液，即制得濃度為67.8 μg/ml對照品溶液，保存于4 ℃冰箱中備用。供試樣品溶液制備：將收集到的不同產地油用牡丹根皮樣品烘干至質量恒定，制粉。取粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz) 30 min，冷卻，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液1 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻后過 0.45 μm 的濾膜，濾液為供試樣品溶液，保存于4 ℃冰箱中備用。

標準曲線的繪制:精密量取丹皮酚標準 5 ml、10 ml、15 ml、20 ml和25 ml溶液，并分別置于10.0 ml的容量瓶中，采用甲醇定容，上機檢測。色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)(45∶55；柱溫：25 ℃；流速 1.0 ml/min)；檢測波長：274 nm；出峰時間：4 min；進樣量：10 μl；理論板數按丹皮酚峰計算應不低于5000。在這一條件下，油用牡丹根皮樣品的液相色譜基線平穩，色譜峰數較多，峰形較好，其中主要成分丹皮酚分離度到規定要求。見圖1。以標準品含量(C)為橫坐標，峰面積積分值(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得到丹皮酚的線性回歸方程和線性范圍。見圖2。

圖1 丹皮酚標準曲線圖

圖2 芍藥苷標準品曲線

精密度、穩定性、重復性實驗:①精密度。精確吸取丹皮酚標準溶液10 μl注入高效液相色譜儀測定其峰面積，重復5次，按照“丹皮酚標準曲線的繪制”項下色譜條件進樣測定；②穩定性。按照“丹皮酚溶液制備”項下操作制備溶液，精確吸取丹皮酚標準溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12 h測定按照“丹皮酚標準曲線的繪制”項下測定其峰面積，進樣量10 μl，重復5次；③重復性。取同一批樣品依法制備6分供試品溶液按照“丹皮酚標準曲線的繪制”項下測定峰面積，進樣量10 μl，重復5次；計算RSD以評價實驗的精密度(1.64%)、穩定性(2.68%)、重復性(2.41%)，結果表明儀器設備精密度良好，供試樣品在12 h內穩定性好，重復性良好。

加樣回收實驗:精密稱取已知丹皮酚含量的丹皮酚樣品5份各0.05 g，再分別精密加入丹皮酚標準品15 ml，按照“丹皮酚溶液制備”項下操作制備溶液后再按照“丹皮酚標準曲線的繪制”項下測定峰面積，進樣量10 μl，計算回收率為99.34%和RSD=2.34%，結果表明該方法的回收率良好。

樣品測定:精密稱取不同產地油用牡丹樣品 0.5 g，按照“丹皮酚溶液制備”項下操作制備溶液，分別精密吸取樣品溶液各平行3組10 μl注入液相色譜儀測定峰面積，計算不同產地牡丹藥材的丹皮酚含量。見表2。

1.2.2 芍藥苷含量測定溶液制備:對照品貯備液 取經五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，即制得濃度為65.4 μg/ml對照品溶液，保存在 4 ℃ 冰箱中備用。供試樣品溶液:將收集到的不同產地油用牡丹根皮樣品烘干至質量恒定，制粉。取粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，浸泡4 h，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)20 min，冷卻，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻后過0.45 μm的濾膜，濾液為供試樣品溶液，保存在4 ℃冰箱中備用。

標準曲線的繪制:精密量取芍藥苷標準溶液2 ml、4 ml、6 ml、8 ml和10 ml分別置于25 ml容量瓶中，用甲醇定容，上機檢測。色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水(B)-乙腈(C)(86∶14；柱溫：25 ℃；流速1.0 ml/min)；檢測波長：250 nm；出峰時間：15 min；進樣量：10 μl；理論板數按芍藥苷峰計算應不低于2000。在這一條件下，油用牡丹根皮樣品的液相色譜基線平穩，色譜峰數較多，峰形較好，其中主要成分芍藥苷分離度達到規定要求。見圖3。以標準品含量(C)為橫坐標，峰面積積分值(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得到芍藥苷的線性回歸方程和線性范圍，結果表明，線性關系良好。見圖4。

精密度、穩定性、重復性試驗：①精密度。精確吸取芍藥苷標準溶液10 μl注入高效液相色譜儀測定其峰面積，重復5次，按照“芍藥苷標準曲線的繪制”項下色譜條件進樣測定；②穩定性。按照“芍藥苷的溶液制備”項下操作制備溶液，精確吸取芍藥苷標準溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12 h按照“芍藥苷標準曲線的繪制”項下測定其峰面積，進樣量10 μl，重復5次；③重復性。取同一批樣品依法制備6份供試品溶液“芍藥苷標準曲線的繪制”項下測定峰面積，進樣量10 μl，重復5次。計算RSD以評價試驗的精密度(1.89%)、穩定性(2.34%)、重復性(2.67%)，結果表明儀器設備精密度良好，供試樣品在12 h內穩定性好，重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已知芍藥苷含量的芍藥苷樣品5份各0.05 g，再分別精密加入芍藥苷標準品15 ml，按照“芍藥苷的溶液制備”項下操作制備溶液后再按照“芍藥苷標準曲線的繪制”項下測定測定峰面積，進樣量10 μl，計算回收率(100.34%)和RSD(2.41%)，結果表明該方法的回收率良好。

樣品測定：精密稱取牡丹樣品0.1 g，按照“芍藥苷的溶液制備”項下操作制備溶液，分別精密吸取樣品溶液各平行3組10 μl注入液相色譜儀測定峰面積，計算不同產地牡丹藥材的芍藥苷含量。見表2。

表2 不同產地牡丹藥材含量測定結果

2 結果與分析

2.1 丹皮酚和芍藥苷的標準曲線隨著丹皮酚含量(C)升高，峰面積(A)呈上升趨勢，二者存在線性關系，其直線回歸方程為：y=83.305x+0.9781(R2=0.9996)。表明丹皮酚含量在 0.339～1.695 μg與峰面積有良好的線性關系。見圖1。隨著芍藥苷含量(C)升高，峰面積(A)呈上升趨勢，二者存在線性關系，其直線回歸方程為：y=19.127x+0.0096(R2=1)。表明芍藥苷含量在 0.1308～0.654 μg與峰面積有良好的線性關系。

2.2 丹皮酚和芍藥苷的含量丹皮酚：精密度、穩定性、重復性實驗丹皮酚樣品溶液的RSD分別為1.64%、2.68%、2.41%，結果表明儀器設備精密度良好，供式樣品在12 h內穩定性好，重復性良好；加樣回收率(99.34%)和RSD(2.34%)，結果表明該方法的回收率良好。從表2 可見：不同產地油用牡丹根部丹皮酚的含量：黔西縣杜鵑街道大興社區1.84%、赫章縣六曲河鎮2.15%、威寧縣白馬村2.22%、畢節市楊家灣1.49%、金沙縣茶園鎮石鐘村1.57%、百里杜鵑管理區1.71%、織金縣官寨鄉2.12%、大方縣雨沖鄉2.68%；不同引種地油用牡丹丹皮酚的含量依次：大方縣雨沖鄉>威寧縣白馬村>赫章縣六曲河鎮>織金縣官寨鄉>黔西縣杜鵑街道大興社區>百里杜鵑管理區>金沙縣茶園鎮石鐘村>畢節市楊家灣；丹皮酚的含量最高的是大方縣雨沖鄉，其次是威寧縣白馬村，再次是赫章縣六曲河鎮。從圖3看出，牡丹藥材與丹皮酚標準品在相同的保留時間下有相同的峰值出現。

圖3 丹皮酚標準品和牡丹藥材的HPLC圖

芍藥苷：精密度、穩定性、重復性實驗芍藥苷樣品溶液的RSD分別為1.89%、2.34%、2.67%。結果表面儀器設備精密良好，供試樣品在12 h內穩定性好，重復性良好；加樣回收率(100.34%)和RSD(2.41%)，結果表明該方法的回收率良好。從表2 可見：不同產地油用牡丹根部芍藥苷的含量：黔西縣杜鵑街道大興社區1.47%、赫章縣六曲河鎮1.52%、威寧縣白馬村1.23%、畢節市楊家灣2.68%、金沙縣茶園鎮石鐘村1.69%、百里杜鵑管理區1.93%、織金縣官寨鄉1.94%、大方縣雨沖鄉2.29%；不同引種地油用牡丹芍藥苷的含量依次：畢節市楊家灣>大方縣雨沖鄉>織金縣官寨鄉>百里杜鵑管理區>金沙縣茶園鎮石鐘村>赫章縣六曲河鎮>黔西縣杜鵑街道大興社區>威寧縣白馬村；芍藥苷的含量最高的是畢節市楊家灣，其次是大方縣雨沖鄉，再次是織金縣官寨鄉。

從圖4可知，牡丹藥材與丹皮酚標準品在相同的保留時間下有相同的峰值出現。

圖4 芍藥苷標準品和牡丹藥材的HPLC圖

3 結論

目前，對油用牡丹的研究主要集中在栽培技術、產油情況以及其油質研究方面，對其藥材質量控制和藥材鑒別相對研究較少。本實驗采用高效液相色譜法對畢節市不同引種地油用牡丹藥材質量含量測定。高效液相色譜法具有重現性好、分離效能高、分析速度快等優點，成為藥材與中藥制劑質量控制、有效成分及其含量檢測中應用最廣泛的指紋圖譜建立方法[14]。

本研究表明，以丹皮酚為指標，流動相：甲醇(A)-水(B)(45∶55/V∶V；柱溫：25 ℃；流速1.0 ml/min)的條件下；油用牡丹藥材質量最好的是大方縣雨沖鄉，其次是威寧縣白馬村，再次是赫章縣六曲河鎮；以芍藥苷為指標，在流動相：水(B)-乙腈(C)(86∶14；柱溫：25 ℃；流速1.0 ml/min)的條件下，油用牡丹藥材質量最好的是畢節市楊家灣，其次是大方縣雨沖鄉，再次是織金縣官寨鄉。最終針對油用牡丹根皮中的丹皮酚和芍藥苷2種有效成分綜合分析下來畢節市大方縣雨沖鄉引種栽培的油用牡丹藥材質量最好。

本實驗采集的油用牡丹樣品覆蓋畢節市管轄的范圍，樣品收集覆蓋范圍較為全面，最終實驗結果能代表本轄區油用牡丹藥材的質量；可為油用牡丹樣品質量控制提供方法支撐，為畢節市油用牡丹引種與質量控制提供科學依據。同時，本實驗尚未對油用牡丹根皮中丹皮酚和芍藥苷以外的其他有效成分進行質量分析測定，下一步將進行深入研究，以得出更為全面的實驗結果，檢測方法可為貴州省27個產業鏈之中藥材產業鏈的發展，為畢節實驗區中藥材產業結構調整、藥材種植和發展提供參考依據。