轉基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白的時空表達分析

李東陽 肖冰 王晨堯 楊現明 梁晉剛 吳孔明

（1.農業農村部科技發展中心，北京 100176；2.中國農業科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3.中國農業科學院棉花研究所 棉花生物學國家重點實驗室，安陽 455000；4.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

玉米（Zea mays）是我國最重要的糧食作物之一，也是畜牧業和飼料工業的主要原料，玉米產業的健康發展是國家糧食安全和農產品有效供給的重要保障［1-2］。在整個生育期內，玉米會受到多種害蟲的為害，嚴重影響其產量和品質［3-5］。其中，亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）是玉米生產中的主要害蟲之一，在我國各玉米產區均有不同程度的發生，常年發生面積2 000 萬hm2以上［6-8］。室內生測和田間抗性鑒定結果表明，轉基因抗蟲玉米對亞洲玉米螟具有很好的殺蟲效果和田間抗螟性［9-11］。轉基因抗蟲玉米新品種不僅是防治農業害蟲的有效途徑之一，而且有利于保護生態環境、提高農民收入［3-4,12-13］。自1996年轉基因抗蟲玉米首次商業化種植以來，全球已有超過200 個轉基因抗蟲玉米轉化事件被批準商業化生產。根據國際農業生物技術應用服務組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA）的統計數據，2019年，全球31%的玉米是轉基因玉米，其中抗蟲玉米和抗蟲耐除草劑玉米種植面積5 590 萬hm2［1-15］。我國是玉米的主要生產國和消費國，對轉基因玉米的研究一直都是研究熱點［16］。

轉基因作物中外源Bt 殺蟲蛋白在特定器官和特定時間的表達具有明顯的時空動態變化規律，且地域、環境等因素對外源殺蟲蛋白表達有一定的影響［9,17-21］。轉Bt基因抗蟲玉米的抗蟲性強弱與植株體內的外源殺蟲蛋白含量密切相關，因此，準確定量出Bt 殺蟲蛋白在不同生育期和不同器官中的表達量，對于未來轉Bt基因抗蟲玉米產業化后的害蟲防治和農業轉基因生物安全管理具有重要意義［11,22］。

轉cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125，是由杭州瑞豐生物科技有限公司/浙江大學共同研發的轉基因玉米轉化事件，2020年1月21 號獲得了在北方春玉米區的農業轉基因生物安全證書（生產應用），是國產轉基因玉米的重要代表。瑞豐125 及相關衍生品系如能順利產業化，將為亞洲玉米螟、黏蟲（Mythimna separata）等玉米主要鱗翅目害蟲的防治提供可供選擇的新途徑，降低玉米種植成本，提升我國玉米競爭力。

為了明確瑞豐125 在不同地域、不同環境中的Bt 殺蟲蛋白的表達規律，本文以轉基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 和對照非轉基因玉米宏碩899 為研究對象，采用酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）全面分析了不同地區種植環境下，Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白的表達量及變化規律。

1 材料與方法

1.1 材料

轉基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 及非轉基因對照玉米宏碩899 均由浙江大學/杭州瑞豐生物科技有限公司提供。瑞豐125 同時表達Cry1Ab/Cry2Aj和G10evo-EPSPS 蛋白，具有抗蟲和耐除草劑兩種特性。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 兩個玉米品種分別在我國玉米種植區的9 個地點按照結構庇護所方式進行種植，種植和栽培方式均采用當地常規耕作管理的模式進行，本試驗連續進行兩年。9 個地點分別為：黑龍江哈爾濱（45°44'N，126°42'E）、吉林長春（43°48'N，125°24'E）、遼寧沈陽（41°49'N，123°33'E）、河北廊坊（39°51'N，116°60'E）、山東煙臺（37°29'N，121°16'E）、河南新鄉（35°10'N，113°41'E）、湖北武漢（30°44'N，114°46'E）、貴州貴陽（26°38'N，106°38'E）、新疆庫爾勒（41°45'N，86°12'E）。

瑞豐125 和宏碩899 兩種玉米材料各設3 次重復，每個小區面積為200 m2（20 m×10 m），行距60 cm，株距25 cm，小區之間的間隔為1-1.5 m。

1.2.2 田間取樣 在玉米生長的不同時期，即拔節期（V6-V8）、抽雄期（VT）、吐絲期（R1）、成熟期（R4）等時期取樣，小區內50%以上的植株進入相應生育期時，判斷為該小區到達相應采樣時間。每小區3點取樣，每點選取1 株進入相應時期的玉米植株，按不同部位分類采集樣品，同一小區同一部位樣品剪碎混合。

采集的玉米組織樣品放入自封袋中，然后立即放入盛有干冰的泡沫盒內，帶回室內轉入-80℃冰箱保存。玉米各組織具體采樣方法如下：（1）葉片：選取幼嫩葉片，從葉片頂端開始截取20 cm 葉片，隨后剪成2.5 cm 小段；（2）雄穗：1 株玉米選取1個雄穗，隨后剪成2.5 cm 小段；（3）花絲：雌穗套袋，將雌穗連同套袋一起拿到無花粉的環境中，將花絲從雌穗上剪下，剪成2.5 cm 小段；（4）籽粒：在同一植株上隨機采集15 粒大小一致的幼嫩籽粒。

1.2.3 Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量測定 采用Cry1Ab/Cry1Ac 酶聯免疫（ELISA）定量檢測試劑盒（Envirologix，Portland，USA，貨號10433）測定Cry1Ab/Cry2Aj 融合殺蟲蛋白的含量，按照說明書操作，具體方法參考Zhang 等［23］的研究，本研究中瑞豐125 中外源殺蟲蛋白Cry1Ab/Cry2Aj 含量以Cry1Ab 殺蟲蛋白含量為代表計為μg/g 鮮重。

首先使用Retsch MM400 組織破碎儀（Retsch GmbH,Haan,Germany）將所有樣本在低溫下粉碎為粉末，然后保存在-80℃冰箱中。稱取0.4 g 組織粉末加入4 mL 提取液PBST（pH 為7.4、濃度為0.01 mol/L 的PBS+0.55% Tween 20），置于搖床上4℃過夜；12 000 r/min 離心15 min，取上清液，用提取液適量稀釋；將Cry1Ab 標準品梯度稀釋，在96 孔酶標板每孔加入50 μL enzyme-conjugate Cry1Ab 后，分別加入50 μL 樣品、陰性對照和標準品，用封口膜將酶標板封閉，輕搖混勻20-30 s，置于搖床上（200 r/min）1-2 h；用力棄去液體后，每孔加入200 μL 洗滌液，反復洗滌3 次后用吸水紙吸干；每孔加入100 μL 顯色底物，用封口膜將酶標板密封，外覆錫箔紙避光，輕搖混勻20-30 s，室溫放置15-30 min；每孔加入100 μL 終止液終止反應，用Infinite M200 Pro 酶標儀（Tecan,M?nnedorf,Switzerland）在450 nm 波長下測定OD 值。

1.2.4 數據分析 根據試驗數據，采用SPSS 25.0 統計軟件（SPSS Inc.,Chicago,USA）進行方差分析，分析方法采用One-way ANOVA，多重比較方法采用LSD 法。

2 結果

2.1 瑞豐125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達量

ELISA 測定結果表明，對照玉米宏碩899 中未檢出Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白；瑞豐125 在2019年各處理試驗中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量為0.590-6.716 μg/g 鮮重（表1），在2020年各處理試驗中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量為0.326-11.133 μg/g 鮮重（表2）。

表1 瑞豐125 各生育期不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量Table 1 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different tissues at different growth stages（2019）

表2 瑞豐125 各生育期不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量Table 2 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different tissues at different growth stages（2020）

在兩年的試驗中，2019年的廊坊、煙臺、新鄉和2020年的哈爾濱、長春、沈陽、廊坊、煙臺、新鄉的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現葉片>花絲>雄穗>籽粒的趨勢；2019年的武漢、貴陽、庫爾勒和2020年的庫爾勒的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現花絲>葉片>雄穗>籽粒的趨勢；2019年的長春和2020年的武漢的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現葉片>雄穗>花絲>籽粒的趨勢；2019年的沈陽和2020年的貴陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現葉片>雄穗>籽粒>花絲的趨勢；2019年的哈爾濱的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量呈現籽粒>葉片>花絲>雄穗的趨勢。整體上看，各地點種植的瑞豐125 呈現出葉片中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較低的規律。

對于瑞豐125 在不同地點的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量表達情況，2019年的結果顯示，V6-V8葉片中貴陽、哈爾濱的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，VT 雄穗中廊坊、武漢、沈陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R1 葉片中長春、廊坊、沈陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R1 花絲中貴陽、武漢的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R4 葉片中廊坊、新鄉的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R4 籽粒中哈爾濱的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高。2020年的結果顯示，V6-V8 葉片中沈陽、新鄉的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，VT雄穗中貴陽、武漢的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R1 葉片中沈陽、煙臺的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R1 花絲中庫爾勒、新鄉的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R4 葉片中新鄉、廊坊的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高，R4 籽粒中沈陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高。整體上看沒有明顯的空間變化規律。

為了從整體上明確瑞豐125 不同器官之間Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量的規律，將9 個地點的數據平均后進行統計分析，結果如圖1所示。2019年和2020年的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量數據均表現出R4 葉片>V6-V8 葉片>R1 葉片>R1 花絲>VT 雄穗>R4 籽粒的趨勢，R4 葉片Cry1Ab/Cry-2Aj 殺蟲蛋白含量為4.299 μg/g 鮮重（2019年）/4.734 μg/g 鮮重（2020年），R4 籽粒Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量為1.430 μg/g 鮮重（2019年）/1.210 μg/g 鮮重（2020年）。對于V6-V8、R1、R4 三個時期的葉片，Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量隨著生育期的延長，有略微的增長，但3 個時期之間的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量均沒有顯著性差異（P>0.05）。

圖1 瑞豐125 不同生育期的不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達量Fig.1 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different tissues at different growth stages

2.2 不同地點種植的瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達量

為了從整體上明確在不同地點種植的瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量的變化規律，將9 個地點各器官樣品Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量平均后進行統計分析，結果如圖2所示。在不同地點種植的瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量有差異，但整體差異較小。2019年各個地點Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達量范圍為1.664-3.771 μg/g鮮重，貴陽高于其他地區，但與長春、沈陽、廊坊、煙臺、武漢沒有顯著性差異，庫爾勒顯著低于其他地區。2020年各個地點Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量范圍為2.423-4.605 μg/g 鮮重，沈陽顯著高于其他地區，長春、武漢低于其他地區，但與廊坊、煙臺、貴陽、庫爾勒沒有顯著性差異。

圖2 瑞豐125 在不同地點的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量Fig.2 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different locations

3 討論

在轉Bt基因抗蟲玉米中，Bt 殺蟲蛋白的表達量可能因組織類型、發育時期和環境狀況而異［24］，了解Bt 殺蟲蛋白表達量的時空動態變化規律對害蟲的綜合防治和農業轉基因生物安全評價管理具有重要意義。本研究通過測定在9 個地點種植的轉基因抗蟲玉米瑞豐125 在各生育期不同器官Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達量，明確了瑞豐125Bt 殺蟲蛋白表達量的時空變化規律，有利于為其未來的商業化推廣和安全管理提供數據參考。

2019-2020 兩年的試驗結果表明，瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量在不同的玉米器官中差異較大，整體上看，葉片中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量較高而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量較低，隨著作物生長，葉片中Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達量略有上升，結果與前人研究結果一致［11,25-28］。孫紅煒等［11］研究發現，轉cry1Ab /cry2Aj和g10evo-epsps基因玉米雙抗505-12-5 在玉米大喇叭口期、吐絲期、乳熟期，心葉中的Bt 殺蟲蛋白含量均高于根、莖。Liang 等［25］研究發現，不同地點種植的轉cry1Ab和epsps基因抗蟲耐除草劑玉米DBN9936，葉片Bt 殺蟲蛋白含量高于花絲、雄穗、籽粒，籽粒中Bt 殺蟲蛋白含量較低。Trtikova 等［26］研究發現，轉基因抗蟲玉米MON810 葉片、根部、莖稈、籽粒之間的Bt 殺蟲蛋白含量差異較大，組織之間Bt 殺蟲蛋白含量水平為葉片>根>莖>籽粒>花粉，且Bt 殺蟲蛋白含量隨生長時期延長而逐漸增加。劉允軍和王國英對轉基因抗蟲玉米97Y6 Cry1A殺蟲蛋白的含量進行了分析發現，葉片Bt 殺蟲蛋白含量顯著大于其他組織，且隨生育期呈增加趨勢［27］。Bilbo 等［24］測定了DKC64-24 等6 個轉基因抗蟲玉米品種的不同組織Bt 殺蟲蛋白含量，發現Cry1F、Cry2Ab2 殺蟲蛋白含量在玉米葉尖大于花絲、籽粒，且不同年份之間有一定差異。Darvas 等［28］對轉基因抗蟲玉米MON810 進行測定發現，花絲中Cry1Ab含量低于葉片、莖稈。

本研究發現在9 個地點種植的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量有差異，但整體差異較小。2019年有6 個地點的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量沒有顯著性差異，2020年有7 個地點的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量沒有顯著性差異，兩年中僅有個別地點出現偏高或偏低的情況。不同地點Bt 殺蟲蛋白表達量之間存在的差異可能與當地氣候條件、土壤狀況、耕作措施等有關。如Trtikova 等［26］研究表明轉基因抗蟲玉米品系PAN 6Q-321B 和 PAN 6Q-308B（均為MON810 衍生品系）在冷/濕應激下的Bt 殺蟲蛋白表達量增加了4 倍，表明Cry1Ab 殺蟲蛋白表達水平與水分和溫度條件有關。王家寶等［29］以3 個轉Bt基因棉花品種魯棉研15 號、魯S6177 和新棉33B為研究對象，發現3 個品種轉基因抗蟲棉花的主莖老葉的Bt 殺蟲蛋白含量在追肥處理后增加29.7%，3 個品種轉基因抗蟲棉花的功能主莖葉、幼蕾、主莖老葉的Bt 殺蟲蛋白含量在積水處理后分別下降27.7%、29.9%、6.6%，新棉33B 的功能主莖葉、幼蕾、主莖老葉的Bt 殺蟲蛋白含量在干旱處理之后分別下降30.0%、37.0%、52.9%。Marquardt 等［30］發現土壤中氮含量與轉Bt基因抗蟲玉米DeKalb 61-19的Cry3Bb1 殺蟲蛋白表達量有一定的正相關性。Griffiths 等［31］發現轉Bt基因抗蟲玉米MEB307Bt（MON810 衍生品系）中的Cry1Ab 殺蟲蛋白表達量在不同類型土壤中具有顯著性差異，且不同時期的葉片中Cry1Ab 殺蟲蛋白表達量在施用溴氰菊酯后均顯著增加。由于本研究的9 個地點之間氣候條件、土壤狀況等相差較大，而且測定環境、取材方法、人員操作習慣、樣品儲存環境等均會對測定結果產生一定影響，導致不同地點的Bt 殺蟲蛋白表達量之間存在微小差異，個別地點如貴陽、庫爾勒、沈陽在試驗中出現Bt 殺蟲蛋白表達量偏高或偏低的情況。

亞洲玉米螟、黏蟲等鱗翅目害蟲是我國玉米生產上最嚴重的生物脅迫問題，玉米螟在東北春玉米區和新疆南疆等地主要為1、2 代危害，在黃淮海夏玉米區主要為3 代危害，黏蟲主要以2、3 代連續危害［8］，瑞豐125 在拔節期（V6-V8）、吐絲期（R1）、成熟期（R4）的葉片中Bt 殺蟲蛋白表達量相對較高，有利于對1、2 代玉米螟和黏蟲的防治。本研究中測定的籽粒、花絲、雄穗等玉米繁殖器官的Bt 殺蟲蛋白含量略低于葉片，與前人研究結果一致，但相關的抗蟲試驗表明瑞豐125 無論是在心葉期還是穗期，對玉米螟、黏蟲均具有高抗水平［11,32］。翁綠水等［20］在對抗蟲水稻Bt 殺蟲蛋白的研究中指出，雖然Bt 殺蟲蛋白表達量在不同時期、不同組織中存在差異，但目前研發的抗蟲植物品種足以有效控制目標害蟲的危害。但由于植物中Bt 殺蟲蛋白表達規律的復雜性，未來的研究中抗蟲性生物測定也是不可或缺的。除此之外，9 個不同地點種植的瑞豐125的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量整體差異較小，表示瑞豐125 可能在不同的玉米生產區具有相對一致的害蟲防治效果，對其產業化具有重要意義。

轉Bt基因抗蟲玉米中的Bt 殺蟲蛋白表達量受各種因素影響，導致Bt 殺蟲蛋白在時間上和空間上的分布不均勻，而低劑量的Bt 殺蟲蛋白可能會增加靶標害蟲的生存幾率，引起靶標害蟲的抗性風險增加［24］。靶標害蟲對Bt 殺蟲蛋白的抗性問題是對影響Bt 作物可持續推廣的最大因素，靶標害蟲的抗性治理是轉基因玉米生產應用的重要環境問題［33］。為了實現轉基因作物的可持續應用，有效阻止或延緩靶標害蟲抗性種群的發生，各國科學家提出了抗性治理策略IRM（insect resistance management），目前應用最廣泛的主要有“高劑量/庇護所”（high dose/refuge）策略和“多基因”（pyramid）策略［34］。在“高劑量/庇護所”策略中，在Bt 作物周邊種植一定面積的非Bt 作物，提供足夠數量的敏感個體，與來自Bt 作物區存活的少量抗性純合子個體進行自由交配，產生的雜合子個體后代能被高劑量表達Bt殺蟲蛋白的抗蟲作物殺死，達到稀釋抗性基因的目的［35］。轉Bt基因玉米表達高劑量Bt 殺蟲蛋白是策略成功實施的關鍵。高劑量Bt 殺蟲蛋白能夠殺死靶標害蟲中的100%隱性敏感純合（ss）個體和99%抗性雜合（sr）個體，僅有抗性純合（rr）個體可能存活［32,36-39］。“高劑量/庇護所”策略主要分為3 種形式：結構庇護所（structured refuges）、種子混合庇護所（seed blends）、自然庇護所（natural refuge）。結構庇護所為Bt 作物和非Bt 作物分別以塊狀模式種植來降低害蟲的抗性進化速度，種子混合庇護所為種植之前均勻混合Bt 作物種子和非Bt 作物種子，自然庇護所是指可以提供敏感害蟲的雜草或其他栽培植物［40］。在“多基因”策略中，在同一株植物中同時導入兩個或多個沒有交互抗性的針對同一靶標害蟲的抗蟲基因，使得轉基因植物產生抗性的風險減小，可有效延緩抗性的產生和發展［36-37,40］。瑞豐125 可以同時表達Cry1Ab 和Cry2Aj 兩種不同類型的殺蟲蛋白，與僅含單一Bt 殺蟲蛋白的植株相比，這種“多基因”作物對害蟲的抗性治理起到積極的作用。

4 結論

轉cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白呈現出葉片中表達量較高，而籽粒中表達量較低的規律，不同地點種植的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達量有所差異，但差異整體較小，表明瑞豐125 具有良好的應用前景。本研究可為未來瑞豐125 的商業化推廣、構建Bt 玉米防控技術體系、庇護所策略實施、安全管理等提供數據支撐和參考。