植物長鏈非編碼RNA調控發育與脅迫應答的研究進展

李建建 賀宸靖 黃小平 向太和

（1.杭州師范大學哈爾科夫學院，杭州 311121；2.杭州師范大學生命與環境科學學院，杭州 311121）

全基因組和轉錄組分析表明，超過75%的人類基因組和50%的擬南芥基因組轉錄成RNA；其中，mRNAs 僅占約1.5%，更多的是缺乏蛋白質翻譯潛力的非編碼RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs）。非編碼RNAs 包括管家ncRNAs（rRNAs，tRNAs，snRNAs 和snoRNAs）和調控ncRNAs；早期研究更多關注在真核生物轉錄和轉錄后調控方面發揮功能的microRNAs 和小干擾RNAs［1-2］。但是，近期研究鑒定了越來越多的長鏈非編碼RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs），其在調控真核生物的生長發育過程發揮重要作用［3］。

由于lncRNAs 表達水平和保守性低，一度被認為是轉錄副產物。伴隨高通量測序技術的快速發展，傳統中心法則和基因調控理論受到前所未有的挑戰，許多具有關鍵調控功能的lncRNAs 被鑒定。相對動物lncRNAs，植物lncRNAs 的研究仍處于探索階段。本文主要針對植物lncRNAs 的來源及分類、作用機制、植物中已鑒定的lncRNAs 及其生物學功能進行綜述，為lncRNAs 在作物生產育種中的應用研究提供參考。

1 lncRNAs 的來源及分類

與蛋白編碼基因mRNAs 一樣，大多數lncRNAs具有5'-帽子、3'-poly（A）尾巴和選擇性剪接位點等結構。另外，lncRNAs 主要被RNA 聚合酶Pol II轉錄，少數也可由RNA Pol IV 和Ⅴ轉錄產生。但是，目前對于lncRNAs 的起源尚無明確定論，其可能的來源主要有以下5 種：（1）蛋白編碼基因在轉錄過程中結構發生中斷形成lncRNA；（2）非編碼基因在復制過程發生反移位形成lncRNA；（3）在染色質重組過程中，未轉錄基因與其他獨立基因形成串聯，產生lncRNA；（4）在基因組序列中插入轉座子形成lncRNA；（5）局部復制子結構發生串聯產生lncRNA。

根據lncRNA 與蛋白編碼基因的相對位置，可以將lncRNA 分為5 類，包括正義lncRNA（sense lncRNA）、反義lncRNA（antisense lncRNA）、基因間lncRNA（intergenic lncRNA）、內含子lncRNA（intronic lncRNA）和雙向lncRNA（bidirectional lnc-RNA）［2］。

2 lncRNAs 的作用機制

大多數lncRNA 沒有蛋白質編碼能力，但有些lncRNA 具有小的開放閱讀框，能夠編碼短肽。另外，lncRNA 可以通過調控基因轉錄、組蛋白修飾、RNA加工、以及與小RNA 作用發揮功能。有文獻報道lncRNA 主要以信號分子、誘餌分子、引導分子和支架分子4 種形式參與生物學過程（圖1）［4］。

圖1 lncRNA 四種作用機制示意圖Fig.1 Schematic diagram of the four archetypes of lncRNA mechanism

在春化作用研究中，開花基因FLC的表達受lncRNA（COOLAIR和COLDAIR） 的調控，而COLDAIR的表達變化影響擬南芥應答春化［5］；另外，有研究報道了一個光敏育性相關lncRNALDMAR，其序列產生C-G 的單堿基突變導致其表達水平降低，花藥PCD 提前，造成光敏雄性不育［6］，表明lncRNA 是植物生長發育的一個信號標志。

LncRNA 作為誘餌分子競爭性結合RNA 結合蛋白調控目的基因的表達［4］。此外，lncRNA 作為miRNA 的偽靶標基因與miRNA 相互作用調控靶基因的表達［7］。擬南芥lncRNAIPS1競爭性結合miRNA399 造成其靶基因PHO2大量積累，降低特異性磷轉運基因Pht1；8和Pht1；9的表達，導致根部對磷吸收減少［8］。

LncRNA 作為引導分子指導核糖核蛋白復合體定位在特定位點。LncRNA 通過cis-/trans-調控基因表達。研究表明苜蓿根瘤基因Enod40編碼的lncRNA 能直接與MtRBP1 蛋白結合，參與MtRBP1從細胞核至細胞質中的定位過程［9］。

除了上述3 種作用形式之外，lncRNA 還可以作為骨架分子結合不同蛋白質或者轉錄因子形成蛋白復合體，調控基因上下游效應元件從而激活或者抑制基因轉錄。比如，植物lncRNA 與AGO4 蛋白互相作用，指導siRNA-AGO4 復合體轉移至相關染色質目的位點進行RNA 介導的DNA 甲基化。這類lncRNA 功能復雜，尚不清楚這些骨架復合體如何實現組織和調控。

3 植物lncRNAs 的功能

3.1 lncRNAs調控植物營養器官發育

根、莖、葉等營養器官參與維持植物生命活動。有研究報道，楊樹Lnc12和LncWOX11調控相關mRNAs 的表達從而抑制楊樹不定根的形成與發育［10］。在擬南芥中，lncRNAENOD40或lnc351與核斑RNA 結合蛋白AtNSRs 結合，調控NSR 對下游生長素應答基因的可變剪接，參與側根發育［11］。另外，在大豆［12］、水稻［13］、苜蓿［14-15］中均鑒定了一種與根瘤特異性表達和共生固氮根瘤形成有關的lncRNAENOD40。

與同期野生型棉花相比，過表達靶基因whole_GLEAN_10025325植株的纖維細胞含量減少，韌皮纖維明顯增多；將lncRNALTCONS_00034183及其靶基因共轉化發現，轉基因植株纖維細胞含量減少，纖維含量減少［16］。有研究分析不同發育時期棉花纖維轉錄組數據鑒定了5 個優勢表達lncRNAs，其中lncRNAGhir_A01G011040-RNAi 轉基因株系的纖維顯著變短［17］。另外，Zhao 等［18］發現異源四倍體棉花A 亞基因組中lncRNAXLOC_409583在多倍體化后被激活并參與調控棉花株高。

在紅苞鳳梨中，lncRNAlncABCG11順式調控PORB的表達調控葉色［19］。Wang 等［20］鑒定了一個持續紅光條件下促進擬南芥光形態發生的lncRNAHID1，其能和抑制光形態的光敏色素互作因子PIF3相互作用；在hid1突變體中HID1敲低表達導致PIF3顯著上調表達，促進下胚軸的伸長發育。另外，Liu 等［21］鑒定了一種由R2R3 MYB轉錄因子OsMYB60反義鏈轉錄產生的反義lncRNATWISTED LEAF（TL），TL-RNAi 株系和過表達OsMYB60轉基因株系葉片扭曲，在TL-RNAi 轉基因株系中OsMYB60顯著上調表達，表明反義lncRNATL順式調控OsMYB60參與葉形態發育。植物營養器官的正常發育被認為是轉向生殖發育的基礎，上述研究揭示了lncRNAs 調控植物營養器官的重要作用。

3.2 lncRNAs調控植物生殖器官發育

3.2.1 lncRNAs 調控植物開花 成花轉變是植物生殖發育的一個重要環節，受到包括春化作用在內的多種途徑調控。在春化過程中，開花抑制因子FLC 的表達受表觀遺傳學負向調控，促進FLC上H3K4me3 去組蛋白修飾和H3K27me3 組蛋白修飾，抑制FLC 的表達，解除其對下游開花基因的抑制作用實現開花轉變［22］。研究證實，3 個擬南芥lncRNAs（COOLAIR、COLDAIR、COLDWRAP）均能調控FLC的表達參與開花［5，23-24］。

Zhao 等［3］鑒定了一個自然反義長鏈非編碼RNAMAS，其轉錄于FLC家族成員基因MAF4的反義鏈；相較于野生型，轉基因株系maf4-1及amiRMAS-1/2均提前開花。在擬南芥中，編碼核外泌體組分的兩個基因AtRRP6L1和AtRRP6L2突變導致關鍵開花抑制因子FLC去阻遏，促使早開花生態型擬南芥延遲開花；此外，AtRRP6L 蛋白質影響lncRNAASL的表達進而負調控FLC，影響植物開花進程［25］。全基因組分析鑒定了14 個擬南芥反義lncRNAs，其中lncRNA npc48 過表達轉基因株系開花推遲［26］。Henriques 等［27］鑒定了CDF5的天然反義轉錄本lncRNAFLORE；其中，CDF5 蛋白直接抑制FT基因的轉錄從而延遲開花，FLORE通過抑制CDF1、CDF3和CDF5等幾個基因和增加FT的轉錄促進開花。

在六倍體小麥中，一個轉錄自TaVRN1正義鏈的lncRNAVAS過表達轉基因冬小麥提前開花［28］。開花是高等植物由營養生長向生殖生長轉換的一個關鍵過程，上述研究暗示lncRNA 在植物開花方面的重要性。

3.2.2 lncRNAs 調控有性生殖及花粉發育 花粉發育是植物生殖發育過程中至關重要的部分。Fan 等［29］鑒定了一個光敏不育性位點Pms1編碼一個優先在水稻幼穗中表達的lncRNAPMS1T，其與miR2118結合產生一個長日照條件下優先在光敏雄性不育水稻積累的21 nt phasiRNAs，進而參與水稻生殖發育。另外，LDMAR次級結構的改變會增強LDMAR啟動子區域甲基化修飾水平，導致LDMAR的轉錄顯著受阻，最終造成花藥過早程序性細胞死亡，形成光敏雄性不育［6］。Zhang 等［30］對水稻花藥、雌蕊和授粉后5 d 的種子進行高通量測序，鑒定了多個水稻生殖相關的lncRNAs；其中lncRNAXLOC_057324突變體開花提前，育性顯著降低。

Song 等［31-32］發現lncRNABcMF11表達水平降低造成異常的花粉發育，包括絨氈層降解、小孢子非同步分離及花粉粒的異常發育，最終導致敗育表型。在菜心研究中，過表達lncRNABrLMaP導致花粉發育異常［33］。Huang 等［34］對5 個發育階段的油菜進行RNA-Seq 分析，鑒定了12 051 個lncRNAs；其中lncRNAsbra-eTM160-1和bra-eTM160-2是bramiR160-5p的潛在eTM，其過表達轉基因株系花器官外表正常，但花藥內一半花粉粒小且皺縮，沒有育性、無細胞核及花粉內壁缺失。

在玉米花藥中，敲低lncRNAZm401顯著影響與花粉發育相關基因（ZmMADS2、MZm3-3和ZmC5）的表達，導致小孢子和絨毛層的發育異常，最終造成玉米雄性不育［35］。上述研究結果表明，現已研究的lncRNAs 與植物有性生殖密切相關，相信進一步的研究將發現更多調控植物生殖的lncRNA。

3.2.3 lncRNAs 調控植物成熟與衰老 除了參與花粉發育，lncRNA 也調控植物果實成熟與衰老。Li 等［36］采用CRISPR-Cas9 技術敲除lncRNA1459導致西紅柿果實成熟進程受到抑制，乙烯和番茄紅素的產生受抑制，大量乙烯和類胡蘿卜素相關基因表達水平降低，果實成熟相關基因表達水平顯著性改變。此外，研究報道西紅柿lncRNA1840沉默株系的果實明顯延遲成熟［37］。

眾所周知，水稻高產和早熟是一對影響水稻產量提高的重要矛盾。Fang 等［38］鑒定了一個OsSOC1基因的長非編碼RNA 反義轉錄本Ef-cd；實驗結果表明Ef-cd能夠促進氮利用及提高光合作用速率，進而參與調控水稻成熟。另外，Wang 等［39］從一個水稻產量性狀相關基因簇LRK 上游鑒定了一個反義lncRNALAIR；水稻LAIR過表達引起LRK基因簇部分基因的轉錄上調，改變LRK1基因組位點的組蛋白修飾狀態，導致水稻增產。

田蕓蕓［40］對河套密瓜4 個發育時期的中果皮進行轉錄組測序，鑒定了1 601 個差異表達lncRNAs；其中LNC-003610超表達株系的成熟天數較對照組推遲約7 d，表明LNC-003610是果實成熟的負調控因子。

有研究報道，lncRNA 作為一類新型非編碼RNA，其競爭性結合miRNA 和circRNA，進而調控mRNA 的表達水平。本課題組前期全基因組研究鑒定了水稻葉衰老非編碼lncRNAs 及其共表達靶基因mRNAs；探明衰老相關lncRNAs 既可通過調控其靶基因發揮功能也可通過競爭內源性RNA 網絡調控mRNAs 發揮功能；采用過表達和CRISPR-Cas9 技術的轉基因功能驗證實驗已完成，功能機制被進一步闡明［41］。

3.2.4 lncRNAs 調控種子及胚乳發育 種子休眠是植物生命循環中最關鍵的過渡時期之一，該時期受DOG1基因控制。Fedak 等［42］鑒定了一個反義lncRNADOG1，命名為asDOG1；在種子成熟階段，asDOG1順式負調控種子休眠導致DOG1等位基因特異性抑制并促進萌發。

此外，中山大學陳月琴團隊鑒定了一個母本來源、調控胚乳發育的lncRNAMISSEN；功能研究顯示，超表達MISSEN 導致合胞體階段游離胚乳細胞核數目減少、聚集以及后續細胞化受阻；而MISSENRNAi 導致胚乳細胞化的進程更快，導致種子出現明顯的“大肚子”表型［43］，表明lncRNA 在胚乳發育過程發揮重要作用。

3.3 lncRNAs應答植物非生物脅迫

3.3.1 lncRNAs 應答植物鹽脅迫 植物在整個生命周期會遭受眾多不利的環境，包括鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫、營養脅迫等過程。在磷缺乏條件下，采用RNAi 技術敲低cis-NATPHO1；2表達導致PHO1；2 蛋白減少，損害磷酸鹽從根部向地上部的運輸，導致種子產量減少；相反，在磷供應充足條件下，trans-NATPHO1；2組成型過表達導致PHO1；2表達水平顯著增加；上述結果表明cis-NATPHO1；2在促進PHO1；2 蛋白翻譯、維持磷酸鹽穩態及植物健康方面發揮重要作用［44］。lncRNAMt4是苜蓿中最早被鑒定的磷酸鹽饑餓誘導基因，該基因在Pi 饑餓期間在根中下調表達［45-46］。在低磷脅迫下，擬南芥中的lncRNAIPS1充當miR399的靶標，競爭性結合miR399，增加miR399 靶基因PHO2的表達，維持植株在低磷狀態下的生長［8］。與IPS1一樣，AT4過度表達導致Pi 積累減少，同時IPS1和AT4過度表達均顯著抑制了miR-399對PHO2的切割，表明IPS1和AT4通過抑制miR-399的活性維持磷酸鹽穩態［8］。與野生型相比，過表達npc536擬南芥轉基因株系在鹽脅迫條件下促進根系生長［26］。

Zhang 等［47］發現過表達lncRNA973的擬南芥種子萌發率提高、鮮重增加、根長增加；采用病毒誘導的基因沉默技術敲低lncRNA973的轉基因株系葉片枯萎、黃化。此外，Liu 等［48］鑒定了一個擬南芥lncRNAT5120，過量表達T5120轉基因擬南芥促進硝酸鹽應答、增強硝酸鹽同化、提高生物量和根系發育；T5120可部分恢復硝酸鹽調節轉錄因子NLP7突變株的硝酸鹽信號和同化表型；上述結果表明T5120參與調控硝酸鹽脅迫響應。

在鹽脅迫條件下，過表達lncRNAThSAIR6顯著減輕檉柳細胞的受損程度，增強POD 和SOD 酶活性，降低植株體內H2O2和O2-的含量，提高活性氧的清除能力，有效提高剛毛檉柳的耐鹽性［49］。除此之外，過表達lncRNAThSAIR1-5轉基因株系同樣提高剛毛檉柳的耐鹽性［50］。總之，一定程度的鹽脅迫會引起滲透脅迫和次生氧化脅迫，導致植物養分失衡及抑制植物生長，表明lncRNAs 在鹽脅迫方面的作用至關重要。

3.3.2 lncRNAs 應答植物溫度脅迫 溫度是影響植物生長發育的最重要的環境因子之一，溫度的細微變化能極大地影響植物的生長和發育。

研究發現，超表達lncRNAHAL6擬南芥的萌發率和存活率顯著高于野生型，顯著增強高溫脅迫抗性；反之，RNAi 株系對高溫脅迫敏感，表明lncRNAHAL6參與調控植物高溫脅迫［51］。在擬南芥中，熱激轉錄因子HSFB2a過表達降低反義lncRNAasHSFB2表達水平，導致生殖發育階段的擬南芥生物量提高；反之，asHSFB2過表達抑制HSFB2a表達，導致生物量降低［52］。除此之外，在擬南芥基因組冷敏感區域鑒定了一個lncRNASVALKA，過表達SVALKA抑制CBF1表達調控植物的耐寒性［53］，這些研究揭示了lncRNAs 在溫度脅迫響應過程的重要作用。

3.3.3 lncRNAs 應答植物干旱脅迫 水分缺失是植物生長的主要限制因素之一。植物遭受干旱脅迫時，消耗量大于吸收量，植物細胞內水勢和膨壓降低，導致葉片凋萎，甚至植株死亡。

與野生型擬南芥相比，lincRNA13853功能缺失突變體對外源ABA 的敏感性減弱、耐旱性降低、失水率加快及氣孔孔徑比增大；過表達lincRNA13853植株的氣孔孔徑比減小；上述結果表明lincRNA可能通過調節氣孔形態影響蒸騰速率，最終改變植物的耐旱性［54］。擬南芥過表達轉基因株系At5NC056820-3、At5NC056820-7和At5NC056820-8在干旱脅迫下長勢更好，游離脯氨酸含量是野生型的2-2.5 倍；表明lncRNAAt5NC056820在一定程度上可以提高擬南芥的耐旱性［55］。擬南芥lncRNADRIR在非脅迫條件下表達水平很低，在干旱脅迫下被顯著激活；過表達lncRNADRIR轉基因株系提高干旱脅迫抗性［56］。這些研究表明，lncRNAs 在植物對干旱脅迫的響應中起著不可忽視的作用。

3.3.4 lncRNAs 應答植物其他非生物脅迫 除了鹽脅迫、高/低溫脅迫和干旱脅迫外，植物lncRNAs還參與了其他影響生長發育的脅迫應答。Sun 等［57］鑒定了一個受Fe 缺乏誘導表達的蘋果lncRNAMSTRG.85814；其正向促進SAUR32的表達并激活質子分泌以應答Fe 缺乏。

Wu 等［58］發現AtR8響應低氧脅迫和水楊酸脅迫；在低氧脅迫下，AtR8表達量降低，而在水楊酸脅迫下表達量升高。進一步的研究表明，在擬南芥atr8突變體中，低濃度SA 導致根長顯著變短［59］。

植物激素赤霉素在植物體內發揮重要的生長調節作用。王亞麗［60］鑒定了一個赤霉素響應lncRNAGARR2，采用CRISPR-Cas9 技術獲得的轉基因株系較野生型株高和第二葉鞘長極顯著增加，籽粒長和籽粒寬極顯著降低。

在真核生物基因組中，轉座子元件（transposable elements，TEs）廣泛存在。有研究報道擬南芥TElincRNA 11195突變體對ABA 敏感性降低，具有更長的根系及更高的地上部生物量［61］。

另外，擬南芥APOLO-RNAi 轉基因株系表現為延遲的向地性響應，在不影響側根密度條件下有更長的根系［62］。

3.4 lncRNAs應答植物生物脅迫

植物除了受到非生物脅迫，而且還會受到生物脅迫的作用，包括細菌、真菌、病毒和害蟲的侵害。

有研究報道，過表達lncRNA16397 和SIGRX的轉基因番茄在感染馬鈴薯晚疫病（Phytophthora infestans，P.infestans）后的癥狀和活性氧積累均較野生型更輕、更低，表現為對P.infestans增強的抗性［63］。過表達lncRNA23468的轉基因番茄中miR482b 表達水平顯著降低，miR482b 靶基因NBSLRRs顯著上調表達，導致對P.infestans抗性增強；反之，沉默lncRNA23468轉基因番茄的抗性減弱［64］。經啟動子-β-GUS 融合和酵母單雜交試驗證明lncRNA33732能與WRKY1 啟動子元件相互作用，激活lncRNA33732的表達；lncRNA33732過表達和沉默的轉基因株系誘導RBOH基因的表達，增加H2O2的積累，導致對P.infestans抗性增強；當RBOH基因表達受到抑制時，H2O2積累降低，對病原菌的抗性減弱［65］。過表達lncRNA39026轉基因番茄表現的增強P.infestans抗性；相反，沉默lncRNA39026的轉基因株系抗性減弱［66］。

番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）是一種通過煙粉虱快速傳播的毀滅性番茄病害。Wang 等［67］鑒定了一個番茄lncRNAS-slylnc0957，其沉默導致敏感番茄植株對TYLCV 的抗性增強。此外，番茄lncRNASILNR1不僅影響番茄葉片發育，而且在番茄TYLCV感染期間，與TYLCV 的非編碼基因間區衍生的病毒小干擾RNA 相互作用，從而調控疾病防御［68］。

另外，Yu 等［69］用增強子系統構建的T-DNA 插入株系表現增強的白葉枯抗性。Zhu 等［70］用尖孢鐮刀菌侵染擬南芥，發現lncRNATAR-197轉基因株系發病更早且癥狀更嚴重，TAR-212轉基因株系表現增強的疾病防御抗性。植物免疫應答是一個涉及基因表達轉錄和轉錄后調控的復雜過程。Seo 等［71］采用人工miRNA 技術敲低lncRNAELENA1，發現其轉基因株系表現為PR1 下調表達及對番茄DC3000細菌病原體丁香假單胞菌更敏感；相反，過表達ELENA1的轉基因株系表現為PR1 表達水平上調及增強的病原菌抗性。

Gao 等［72］發現皺縮病毒侵染lincRNALINCAP2過表達植株后其靶基因AP2 下調表達，發病癥狀更嚴重，包括花結構變形。Zhang 等［73］鑒定了兩個棉花lncRNAsGhlncNAT-ANX2和GhlncNAT-RLP7，沉默轉基因幼苗表現為增強的黃萎病和灰霉病抗性。總之，作為植物防御機制的一部分，lncRNAs 在植物病原體等生物響應方面發揮重要作用。

本文綜述了植物lncRNAs 發揮的主要生物學功能并總結了轉基因功能驗證的lncRNAs（表1）。

表1 參與植物發育和脅迫應答的已功能驗證的lncRNAsTable 1 Functional validated lncRNAs involving in plant development and stress response

4 展望

隨著高通量測序技術和生物信息學的快速發展，越來越多的植物和動物lncRNA 被廣泛鑒定。相較于早期研究，lncRNA 并不被認為是轉錄副產物，而是能在表觀遺傳、轉錄調控及轉錄后調控等層面參與基因表達調控的重要基因組分。眾所周知，lncRNA 參與了大量生物學過程，包括生長發育、脅迫、免疫反應、疾病防御等。然而，與mRNA 相關的數據庫相比，lncRNA 植物相關數據庫及其注釋還不夠完全，對其進行深入分析的難度較大；除此之外，lncRNA 的研究還存在一些問題：比如，lncRNA 作用機制復雜；許多lncRNA 的生物學功能無法闡明；非編碼轉錄產物是否有功能依然無法判斷等。

為了更好闡明lncRNA 的生物學功能和作用機制，可以從以下思路入手：采用納米孔測序技術獲得lncRNA 全長、通過單細胞轉錄組和表觀遺傳組建立lncRNA 與染色質之間的聯系、對lncRNA 靶基因進行預測并進行功能驗證；目前，采用過表達和CRISPR/Cas9 技術對lncRNA 及其靶基因的功能驗證仍顯不足，尤其是在植物中的研究。

除此之外，對lncRNA 的報道主要集中在分子機制的研究中，在育種方面鮮見報道。探索lncRNAs 對植物生長發育影響的分子機制的成熟，lncRNA 有望在農業育種、種質創新及品質改良方面發揮重要作用。