AtERF49在擬南芥應答鹽堿脅迫中的作用

阮航 多浩源 范文艷 呂清晗 姜述君 朱生偉

（1.黑龍江八一農墾大學農學院，大慶 163316；2.中國科學院植物研究所植物分子生理學重點實驗室，北京 100093）

土壤鹽堿化是影響植物生長、產量和品質的主要環(huán)境條件之一［1］。據(jù)聯(lián)合國教科文組織（UNESCO）和糧農組織（FAO）的不完全統(tǒng)計，世界上大約有9.5×109km2的鹽堿地，其中我國占9.9×106km2，土壤鹽堿化造成生態(tài)環(huán)境惡化，嚴重威脅我國糧食生產安全［2］。為了適應土壤鹽堿脅迫，植物會通過改變抗逆相關基因表達以及自身的生理生化等響應逆境脅迫［3］。

植物AP2/ERF（APELATA2/ethylene response factors）轉錄因子家族，在植物生長發(fā)育及其非生物逆境脅迫響應過程中具有重要作用［4-5］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中含有147 個成員，根據(jù)其蛋白結構，將AP2/ERF 家族分為5 組，即AP2 亞家族、RAV 亞家族、CBF/DREB 亞家族、ERF 亞家族以及一個特異蛋白AL079349［6］。研究表明，一些ERFs參與植物對干旱、高鹽以及滲透等脅迫的響應過程。過表達RAP2.2（RELATED TO AP2 2）、RAP2.3和RAP2.12（RAPs）可以增強擬南芥對脫落酸（ABA）的敏感性和缺氧、氧化以及滲透脅迫的耐受性［7］。過表達EIN3（ETHYLENEINSENSITIVE3）和ESE1促進鹽反應基因表達，提高植物對鹽脅迫抗性［8］。過表達TSRF1通過調節(jié)脅迫響應基因的表達，提高水稻的滲透和耐旱性［9］。DREB 亞家族轉錄因子受干旱、低溫和鹽等脅迫因子誘導表達，參與植物對非生物脅迫響應過程。如過表達AtDREB1A和OsDREB1A可增強擬南芥對冷凍和脫水耐受性［10-11］。在油菜中，過表達BNCBF/DREB1可增加淀粉和蔗糖生物合成酶含量，提高植株對冷脅迫的抗性［12］。

在擬南芥中，AP2/ERF 轉錄因子家族主要集中于對干旱、高鹽等脅迫的研究，對鹽堿脅迫研究尚未見報道。AP2/ERF 轉錄因子可參與水楊酸、茉莉酸和脫落酸等多種激素信號轉導途徑，其中AtERF49 可能是逆境信號交叉途徑中的關鍵連接因子（未發(fā)表）。AtERF49（AT1G75490）屬于DREB亞家族中A-2 亞組［13］。AtERF49只有1 個外顯子，編碼206 個氨基酸，其蛋白含有一個保守AP2 結構和一個CMIV-1 結構域。

本研究以擬南芥為材料，對其進行混合鹽堿脅迫處理，利用熒光定量PCR 技術對AtERF49基因的基本特性、鹽堿脅迫及光合響應基因表達模式等進行分析，并進行葉片葉綠素熒光參數(shù)測定，研究AtERF49在植物對鹽堿脅迫應答過程中的功能，以期為深入解析AtERF49參與植物抗鹽堿脅迫分子機理提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用到的擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）材料為生態(tài)型Col-0、過表達AtERF49轉基因材料（AtERF49OX-11、AtERF49OX-39）和CRISPR/Cas9突變體CR-erf49材料（erf49-6、erf49-4）。種植條件為22℃，光照周期為16 h 光照/8 h 黑暗。

1.2 方法

1.2.1 轉基因AtERF49擬南芥鹽堿脅迫處理 將在1/2 MS 培養(yǎng)基上生長1 周齡的Col-0、過表達AtERF49轉基因材料、CR-erf49突變體，移栽到8 cm×8 cm 方盒（土∶蛭石=3∶1）中，待長到7-8 片葉子時，進行鹽堿脅迫處理。處理組用150 mmol/L 混合鹽堿（摩爾比NaHCO3∶Na2CO3=9∶1）溶液進行處理，用水作為對照組，每3 d 澆灌一次。

1.2.2 抗逆基因、光合相關基因的RT-qPCR 檢測 將生長16 d 的擬南芥材料經(jīng)鹽堿脅迫處理0、1和6 h 取樣，采用聚合美試劑盒（MF045-05）進行RNA 提取，參照HiScript? Reverse Transcriptase 說明書（Vazyme 公司）進行反轉錄PCR，按照諾唯贊Q111 說明書，以AtUBC30為內參，用RT-qPCR方法檢測轉基因擬南芥中RAB18和RD29A以及光合相關基因rbcl和psaA的表達量。RT-qPCR 的引物見表1。

表1 熒光定量PCR AtERF49 所用引物Table 1 Primers used for fluorescence quantitative PCR

1.2.3 葉綠素熒光參數(shù)測定 擬南芥生長16 d 時進行鹽堿脅迫處理，處理11 d 后，暗處理20 min，利用葉綠素熒光-成像-氣體交換同步測量系統(tǒng)（GFS-DUAL）測定暗適應后植株葉片光化學淬滅系數(shù)（qP）、非光化學淬滅系數(shù)（qN）、光系統(tǒng)II 實際量子產能Y（II）和能量耗散的量子產能（NO）。每個處理重復4 次，每次測定7 株。

1.2.4 統(tǒng)計分析 使用GraphPad Prism 5 軟件對數(shù)據(jù)進行雙因素方差分析及差異顯著性檢驗（Two-way ANOVA）。

2 結果

2.1 鹽堿脅迫促進AtERF49的表達

在Col-0 生長至16 d 時，經(jīng)150 mmol/L 鹽堿溶液處理0、1、3 和6 h 后，檢測擬南芥葉片中AtERF49的表達情況（圖1）。以AtUBC30為內參，鹽堿脅迫處理后，AtERF49的表達量上升，在3 h時達到最高（25 倍），6 h 后，表達量急劇降低，下降97.4%，表明鹽堿脅迫可快速誘導AtERF49表達。

圖1 鹽堿脅迫下AtERF49 表達量分析Fig.1 Analysis of AtERF49 expression under Saline-alkali stress

2.2 過表達AtERF49增加植物對鹽堿的抗性

選取生長4 周齡的轉基因擬南芥葉片，利用RT-qPCR 方法檢測AtERF49的表達水平。結果表明，過表達轉基因植株AtERF49-OX中AtEFR49的表達量均高于Col-0（2-4 倍），而erf49突變體中AtERF49的表達量低于Col-0（圖2-B）。在正常條件下，轉基因擬南芥和Col-0 在葉片大小和顏色上無明顯的區(qū)別（圖2-A）；鹽堿脅迫處理后，Col-0 和erf49突變體植株葉片出現(xiàn)萎蔫和黃化，嚴重者葉片死亡，而過表達AtERF49轉基因植株葉片出現(xiàn)少許黃化（圖2-A）。過表達AtERF49增強植株對鹽堿脅迫的抗性，而erf49突變體植株對鹽堿脅迫更加敏感，表明AtERF49正向調控植物對鹽堿脅迫的響應

圖2 過表達AtERF49 增強擬南芥對鹽堿脅迫的抗性Fig.2 Overexpression of AtERF49 gene increasing Arabidopsis resistance to Saline-alkali stress

2.3 過表達AtERF49增加下游相應基因的表達

為了探究過表達AtERF49增強擬南芥抗鹽堿脅迫的機理，利用RT-qPCR 檢測抗逆響應相關基因RD29A和RAB18的表達。結果表明，在鹽堿溶液處理前（0 h），Col-0、AtERF49- OX 以及erf49中RD29A和RAB18的表達量有明顯的差別，均高于Col-0。鹽堿處理1 h 后，過表達轉基因植株中RD29A和RAB18的表達水平提高，且極顯著高于Col-0，其中，RAB18的表達量為Col-0 的2-3 倍（圖3-A），RD29A的表達量上調6-10 倍（圖3-B），而erf49突變體中AtERF49的表達量較Col-0 顯著降低，其中，RAB18的表達量降低62%-66%（圖3-A），RD29A的表達量降低29%（圖3-B）。

圖3 轉基因AtERF49 植株中RAB18（A）和RD29A（B）的表達分析Fig.3 Expression analysis of RAB18（A）and RD29A（B）in AtERF49 transgenic lines

2.4 鹽堿脅迫下，AtERF49對擬南芥葉綠素熒光參數(shù)的影響

過表達AtERF49增強擬南芥抗鹽堿脅迫的能力，葉片黃化表型較輕（圖2-A），推測其可能影響葉片光合作用能力和光合電子傳遞速率。對轉基因擬南芥和Col-0 的葉綠素熒光參數(shù)qP、qN、Y（II）和NO 進行檢測。結果表明，鹽堿脅迫處理前，轉基因擬南芥和Col-0 植株的qP、qN、Y（II）和NO 均無差異。鹽堿溶液處理后，erf49突變體植株的Y（II）和qP 均低于Col-0，NO 和qN 均高于Col-0（圖4-B和圖4-C）；而AtERF49-OX植株在處理之后，Y（II）和qP 均顯著高于Col-0，NO 和qN 均顯著低于Col-0（圖4-A 和圖4-D）。表明鹽堿脅迫下，erf49突變體植株光損傷程度較嚴重，PSII 反應中心的開放程度降低，ERF49 可能影響光系統(tǒng)II 反應中心光化學反應、開放狀態(tài)以及光損傷程度。

圖4 鹽堿脅迫對轉基因AtERF49 擬南芥葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響Fig.4 Effects of Saline-alkali stress on the chlorophyll fluorescence parameters of leaves of AtERF49 transgenic Arabidopsis

2.5 AtERF49調控光合響應基因表達

在鹽堿脅迫處理前后，對轉基因AtERF49擬南芥蓮座葉光合響應基因psaA和rbcL的表達進行分析，結果（圖5）表明，在正常條件下，psaA、rbcl在AtERF49-OX、erf49和Col-0 中表達量無明顯差異。在鹽堿脅迫處理下，與Col-0 相比，AtERF49-OX植株中rbcL表達量顯著增加（4-5 倍），psaA表達量顯著降低（47%-64%）；而psaA、rbcl在erf49突變體植株表達與AtERF49-OX植株相反。psaA能夠編碼光系統(tǒng)I（PSI）跨膜復合物的中心蛋白A，其作為原初反應中心在光系統(tǒng)I 中起著重要作用，可參與葉綠素分子間的相互作用；rbcL編碼核酮糖1,5 二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）大亞基，調節(jié)rubisco 的合成和活性，rubisco 的活性與葉片的羧化效率及光合作用呈正相關。psaA、rbcl在AtERF49-OX、erf49中表達存在差異，說明ERF49可能通過調控psaA和rbcL表達影響植物光合作用電子傳遞和碳同化能力，進而影響植物對鹽堿脅迫的抗性。

圖5 AtERF49 轉基因株系中rbcL 和psaA 的表達Fig.5 Relative expressions of rbcL and psaA in AtERF49 transgenic lines

3 討論

AP2/ERF 家族轉錄因子作為關鍵調節(jié)因子參與植物對多種非生物脅迫應答過程［14］。植物對鹽堿脅迫應答的基因調控網(wǎng)絡，分為ABA 依賴和非依賴兩大調控網(wǎng)絡［15］，相關的轉錄因子會隨之調控不同下游基因的表達［16］，如植物逆境相關基因RD29A和RAB18。本研究中，在鹽堿脅迫處理1 h 時，AtERF49-OX植株RD29A和RAB18的表達量顯著上升，而erf49突變體中其表達量降低。結合鹽堿處理下植株表型，推測在鹽堿脅迫條件下，AtERF49-OX擬南芥的抗鹽堿脅迫能力提高，可能與ABA 依賴基因RD29A和RAB18的表達增強密切相關。

鹽堿脅迫對植物的影響是多方面的，在影響光合電子傳遞速率的同時也會引發(fā)光合機構的紊亂［17］。Y（II）是光系統(tǒng)II 實際量子產能。本研究中，在鹽堿處理之前，各株系的Y（II）無明顯差異；在鹽堿脅迫處理條件下，erf49突變體Y（II）顯著下降，而AtERF49-OX植株的Y（II）增加，說明鹽堿脅迫下erf49突變體光系統(tǒng)II 反應中心失活程度較嚴重，過表達株系則表現(xiàn)出強的耐受能力。

光化學淬滅（qP）反映PSII 吸收的光能在光化學反應電子傳遞鏈中的份數(shù)，在一定程度上反映PSII 反應中心的開放程度，要想保持高的光化學淬滅就要使PSII 反應中心處于“開放狀態(tài)”。非光化學淬滅（qN）反映植物耗散過剩光能為熱的能力［18-19］。本實驗研究結果表明，在鹽堿脅迫處理前，轉基因株系和Col-0 的qP 和qN 值無明顯差異。在脅迫處理后，AtERF49-OX植株的qP 值在上升，qN 值下降；而erf49突變體則與之相反。這就說明erf49突變體遭受鹽堿脅迫之后，天線色素吸收的光能用于光化學反應的份額在減少，主要轉化成熱量散失。能量耗散的量子產能（NO）是光損傷的重要指標，若NO 值越高，則表示受到的光損傷越嚴重。本研究結果表明，在鹽堿處理條件下，erf49突變體NO 值上升并顯著高于Col-0，而AtERF49-OX植株NO 值下降，erf49突變體在逆境脅迫下更容易受到光損傷。進一步說明過表達AtERF49基因能有效的減少光損傷，在鹽堿脅迫發(fā)生時還能保持較高的光能利用率。

psaA和rbcL是葉綠體中重要生物學功能的基因，psaA能夠編碼光系統(tǒng)I 跨膜復合物的中心蛋白A，又稱P700 脫輔基蛋白A，其作為原初反應中心在光系統(tǒng)I 中起著重要作用，可能參與結合中間電子傳遞體Fx,也可能參與了與葉綠素分子的相互作用［20］；rbcL基因編碼核酮糖1,5 二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1,5-bishosphate carboxylase/oxygenase，rubisco）大亞基，調節(jié)rubisco 的合成和活性，rubisco 在光合作用的暗反應中起重要作用，負責碳同化又引發(fā)光呼吸，其活性與葉片的羧化效率及光合作用呈正相關［21-22］。鹽堿處理前，轉基因株系和Col-0 中psaA和rbcL的表達量無明顯差異。在鹽堿處理后二者基因表達量發(fā)生變化，AtERF49-OX植株的rbcL表達量上升并顯著高于Col-0，psaA表達量顯著下降，erf49突變體株系與之相反。erf49突變體psaA表達量在鹽堿脅迫處理后上升，而AtERF49-OX植株psaA表達量下降，這可能是因為在鹽堿脅迫條件下，光系統(tǒng)I 跨膜復合物中心蛋白A 穩(wěn)定性有關［23］。有研究表明蟲黃藻psbA和psaA轉錄水平的主動降低對抵抗熱應激具有積極作用［24］，可能與鹽堿脅迫中機制是不同的，還需進一步研究。非生物脅迫可導致植物的rubisco 酶活性降低［25］，本研究中，erf49突變體的rbcL表達量在鹽堿脅迫處理之后下降，可能是鹽堿脅迫導致rubisco 合成的轉錄過程和轉錄后翻譯表達受到抑制，使rubisco 合成受阻，從而影響暗反應中的碳同化和葉片的羧化效率，造成葉片黃化。

4 結論

鹽堿脅迫下，AtERF49 通過調控逆境脅迫相關基因RAB18和RD29A的表達以及對植物葉片光合作用相關基因（psaA和rbcL）及電子傳遞等影響，參與植物對鹽堿脅迫的響應過程。