鎘脅迫下水稻OsPT1的表達及功能分析

姜南 石楊 趙志慧 李斌 趙熠輝 楊俊彪 閆家銘 靳雨璠 陳稷 黃進

（1.成都理工大學生態環境學院，成都 610059；2.四川農業大學農學院，成都 611130）

鎘（cadmium，Cd）具有高毒性且不可被生物通過代謝途徑降解［1］，過度積累會抑制水稻光合作用及呼吸作用等生理過程，導致水稻（Oryza sativa）的株高、根長、生物量及產量等明顯降低［2-3］。同時，Cd 具有高遷移性，不僅易被水稻吸收，還會通過食物鏈富集于人體，對人的健康造成損害［4-5］。培育低Cd 積累的水稻品種，減少大米中Cd 的含量，已成為當前應對Cd 污染危害主流的研究趨勢之一［6-8］。研究水稻Cd 吸收、轉運相關基因及功能為水稻應對Cd 脅迫的機制及培育低積累Cd 的水稻品種具有重要的借鑒意義［9］。

研究表明，植物可通過相關的轉運蛋白將重金屬離子轉運至胞外或隔離在液泡及質外體中，以降低重金屬對植物的毒害［10-14］。在這一過程中，部分依賴于H+偶聯的陽離子轉運蛋白發揮重要的調控作用。研究發現，陽離子/H+轉運蛋白CAX（cation/H+exchanger）可依賴跨膜H+質子梯度，將Mn2+、Cd2+等游離金屬離子逆濃度梯度地轉運并隔離在液泡中［15］；而Na+/H+逆向轉運蛋白NHX1（Na+/H+antiporter）則可通過介導細胞質膜上H+濃度，將Cd 轉運出細胞外［16］，這兩種轉運蛋白均可藉此增強植物對Cd 脅迫的耐受性。OsPT1 蛋白（phosphate transporter 1）作為水稻H2PO4-/H+共運體Pht1 蛋白家族中的一員，是一種定位于細胞質膜上的磷酸鹽轉運蛋白，它們通過調控細胞質膜上H+濃度梯度參與水稻對外界磷酸鹽和重金屬砷（As）的吸收及轉運［17］。研究發現，與野生型相比，過表達OsPT1水稻在根和葉片中積累了更多的磷酸鹽和As，當OsPT1突變后，水稻地上部分As 的積累量顯著降低，表明OsPT1不但參與水稻對外源磷酸鹽吸收積累，還可能在水稻應對As 脅迫的過程中發揮作用［18-20］。而水稻Pht1 家族其他成員（如OsPT3、OsPT4、OsPT5、OsPT7、OsPT8 等）也參與水稻對磷酸鹽吸收轉運過程，其中，OsPT4 和OsPT8 還參與對As 的吸收轉運［21-24］。在對馬鈴薯StPT7的研究過程中發現，其野生型、過表達和突變體植株對干旱脅迫的耐受性依次降低，表明Pht1 蛋白還影響植物的干旱脅迫耐受性［25］。亞麻薺Pht1 家族成員響應多種逆境脅迫，其中就包括Cd［26］。

OsPT1 可能通過調控細胞質膜上H+濃度介導水稻Cd 轉運，但當前研究對OsPT1 是否在重金屬Cd轉運中發揮作用尚未闡明。前期利用生物信息學篩選到多個水稻Cd 響應基因，其中包括OsPT1。

本研究以水稻、酵母為材料，克隆OsPT1并對其進行生物信息學分析，構建表達載體，轉化酵母，驗證OsPT1在Cd 脅迫下的功能。利用RT-qPCR 檢測OsPT1在Cd 脅迫下的表達情況，為OsPT1的Cd 響應功能研究及低積累Cd 的水稻品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻種子消毒后，置于37℃150 r/min 催芽2 d。隨后種植于1/2 MS 植物培養基（pH=5.8），30℃光照培養5 d。選取生長狀態良好且株高相近的幼苗，分別種植于含0（對照）和100 μmol/L CdCl2的1/2 MS 培養基進行培養。分別在1、6 和12 h 時取樣，每個時間點取8 株幼苗，對地上部分和根部分別取樣，立即置于液氮速凍，-80℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 水稻總RNA 提取及cDNA 反轉錄 將水稻組織樣品研磨成粉末，利用植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取總RNA，并使用反轉錄試劑盒（默飛世爾科技公司）反轉錄成cDNA。

1.2.2 水稻OsPT1的克隆及表達載體的構建 根據OsPT1登錄號（Locus ID：LOC_Os03g05620），從Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/）網站下載CDS 序列。設計OsPT1引物（上游引物OsPT1-F：5'-ATGGCGGGAGGGCAGCTCAACG-3'；下游引物OsPT1-R：5'-TTACTTCGGGTAGGCCGCCTCC-3'）。PCR 反應體系為引物各1 μL、模板1 μL、金牌Mix 酶44.5 μL、DMSO 2.5 μL，補至50 μL。PCR 反應程序為98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環；72℃ 5 min。PCR產物回收純化后，與pGADT7表達載體連接，并轉化DH5α 大腸桿菌感受態細胞，提取質粒經酶切鑒定正確后送樣測序。

1.2.3OsPT1表達分析 cDNA 稀釋10 倍后作為模板，通過RT-qPCR 檢測OsPT1的相對表達量。反應體系為cDNA 3 μL、上下游引物（表1）各1 μL、2×ChamQ Universal SYBR 5 μL。RT-qPCR 反應程序為95℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 15 s，40 個循環。以ubiquitin為內參基因，每個處理3 次重復，采用2-ΔΔCt相對定量法進行數據分析。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Quantitative real-time PCR primer sequence

1.2.4OsPT1在酵母中的功能分析 使用聚乙二醇（PEG）-乙酸鋰轉化法［27］將pGADT7-OsPT1表達載體與pGADT7空載體（作為陰性對照）轉化到Cd敏感型酵母菌株Δycf BY4741（Mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 YDR135c::kanMX4）中。在亮氨酸缺陷型（SD-Leu）酵母固體培養基上選擇酵母單克隆，接種于SD-Leu 液體培養基中，30℃ 200 r/min 振蕩培養過夜。之后用新鮮的SD-Leu 液體培養基稀釋10 倍后再活化培養2 h，將菌液培養至OD600=0.4-0.8，離心收集細胞，用無菌水調OD600=1。隨后，將5 μL 經梯度稀釋的酵母細胞液（OD600為1.0、0.1、0.01和0.001）點樣到含有2%葡萄糖和25 μmol/L CdCl2的SD-Leu 固體培養基表面，30℃培養3 d，拍照采集數據。

1.2.5 生物信息學分析 利用在線網站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預測分析OsPT1的理化性質。使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html） 分析OsPT1 的二級結構。利用PHYRE2 Protein Fold Recognition Server（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index，對OsPT1 蛋白的三級結構進行預測。通過NetPhos v3.1（http://www.cbs.dtu.dk/se rvices/NetPhos/）預測OsPT1 蛋白可能的磷酸化位點。通過ProtComp（http://linux1.softberry.com/berry.phtm l?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc）網站預測OsPT1 蛋白的亞細胞定位。使用NCBI 中的BLAST 功能，找到不同物種中OsPT1 蛋白的同源序列，并通過軟件MEGA7.0 使用NJ 法構建進化樹。

2 結果

2.1 OsPT1的克隆

以水稻cDNA 為模板進行擴增，獲得一條約1 600 bp 條帶（圖1-A），與重組載體酶切后的產物大小相近（圖1-B）。經測序，獲得的序列與通過Rice Genome Annotation Project 網站查詢得到的OsPT1（LOC_Os03g05620）CDS 序列比對一致，表明成功克隆目的基因。

圖1 OsPT1 的PCR 擴增及pGADT7-OsPT1 重組載體的酶切驗證Fig.1 PCR amplification of OsPT1 gene and endonuclease digestion of the recombinant vector pGADT7-OsPT1

2.2 OsPT1的生物信息學分析

2.2.1 OsPT1 的理化性質預測 利用ExPASy 網站分析OsPT1 的理化性質（表2），OsPT1 蛋白分子質量為57.46 kD，蛋白分子式為C2656H4021N667O710S25。其編碼氨基酸組成（表3）如下，Ala（A）有67 個，所占比例最高，為12.7%，Cys（C）有6 個，所占比例最低，為1.1%。OsPT1帶負電殘基總數（Asp+Glu）34 個，帶正電殘基總數（Arg+Lys）38 個，理論等電點為8.57，不穩定指數為31.09，說明該蛋白為穩定的弱堿性蛋白。由于此蛋白親和性（GRAVY）平均水平為0.361，而從蛋白的親和性分析（圖2）可以看出，處于正值的蛋白比例明顯大于負值部分，說明此蛋白為疏水性蛋白。

圖2 OsPT1 蛋白親疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysis of OsPT1 protein

表2 OsPT1 蛋白的理化性質Table 2 Physicochemical properties of OsPT1 protein

表3 OsPT1 蛋白的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of OsPT1 protein

2.2.2 OsPT1 的二、三級結構預測 運用SOPMA網站預測OsPT1 蛋白的二級結構（圖3-A），發現α-螺旋有260 個氨基酸，占49.34%；延伸鏈有71個氨基酸，占13.47%；β-轉角有24 個氨基酸，占4.55%；無規則卷曲有172 個氨基酸，占32.64%。使用PHYRE2 網站預測OsPT1 蛋白的三級結構（圖3-B），蛋白質中含有大量丙氨酸（Ala），而α-螺旋和無規則卷曲是蛋白質三級結構的主要組成，與二級結構預測結果基本吻合。

圖3 OsPT1 蛋白質的二、三級結構預測Fig.3 Secondary and tertiary structure prediction of OsPT1 protein

2.2.3 OsPT1 蛋白的亞細胞定位及磷酸化位點分析 使用在線工具ProtComp 分析OsPT1 蛋白的亞細胞定位，OsPT1 蛋白主要分布在細胞質膜上。蛋白質的磷酸化可介導蛋白活性，對生物體內很多生理過程都具有重要的調控作用。利用在線軟件Net Phos 3.1 分析OsPT1 潛在的磷酸化位點（圖4）發現，OsPT1 存在34 處潛在的磷酸化位點，包括14 處潛在的絲氨酸（S）磷酸化位點，14 處潛在的蘇氨酸（T）磷酸化位點，6 處潛在的酪氨酸（Y）磷酸化位點，這些磷酸化位點對OsPT1 蛋白行使功能有著重要意義。

圖4 OsPT1 蛋白潛在的磷酸化位點分析Fig.4 potential phosphorylation sites analysis of OsPT1 protein

2.2.4 OsPT1 的系統進化分析 為了研究OsPT1 蛋白在不同物種的進化關系，運用NCBI Blast 查詢與OsPT1 蛋白同源性最高的其他物種的蛋白序列，利用MEGA7.0 軟件鄰接法構建進化樹（圖5）。目的基因編碼的蛋白在雙子葉植物和單子葉植物間分為2 支，與高粱（Sorghum bicolor）的親緣關系最近。

圖5 PT1 蛋白系統進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PT1 proteins

2.2.5OsPT1順式作用元件分析 運用PlantCARE網站分析OsPT1上游2 000 bp 啟動子區序列，通過TBtools 對結果進行可視化處理。結果（圖6）顯示，OsPT1上游2 000 bp 啟動子區含有對光響應作用元件CAG-motif、G-Box、AE-box、ACE、GT1-motif、TCT-motif，對茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif、TGACG-motif，厭氧環境響應元件ARE，對水楊酸響應的元件TCA-element，對逆境響應的元件TC-rich repeats。

圖6 OsPT1 的順式作用元件分析Fig.6 Cis-acting elements analysis of OsPT1 gene

2.3 OsPT1響應Cd脅迫的表達模式

在不同時間Cd 脅迫下，運用RT-qPCR 分析OsPT1水稻幼苗不同組織中的表達情況，并使用GraphPad Prism 9 軟件分析數據。結果表明，在Cd處理濃度100 μmol/L 時，OsPT1在水稻地上部分的相對表達量整體呈上升趨勢。在處理1、6 和12 h 后，OsPT1在植物地上部分的轉錄水平分別上調至處理前的1.31、1.34 和2.46 倍（圖7-A）。而在根中，處理時間為1 和6 h 時，OsPT1的相對表達量上調了1.28和1.14 倍；當處理時間達到12 h 時，OsPT1的相對表達量出現下調，約為0.62 倍（圖7-B）。OsPT1相對表達量的變化表明其能夠響應Cd 脅迫。

圖7 OsPT1 響應Cd 脅迫表達分析Fig.7 Expression analysis of OsPT1 under Cd stress treatment

2.4 轉基因酵母的Cd耐受性分析

將轉基因酵母與空載體酵母經25 μmol/L Cd 處理3 d 后，與對照組（0 μmol/L Cd）相比，轉入目的基因的酵母在含25 μmol/L Cd 的SD-Leu 培養基上生長活性較空載體酵母弱（圖8），表明OsPT1在一定程度上降低了酵母細胞對Cd 的耐受性。

圖8 OsPT1 對酵母Cd 敏感性的影響Fig.8 Effects of OsPT1 on the sensibility of Cd in yeast

3 討論

水稻在進化和發育過程中，形成了一套應對Cd脅迫的調控機制，這些調控機制的發揮依賴各種已知和未知的轉運蛋白以及相關的轉錄調控因子［28-29］。OsPT1 作為一種轉運蛋白，在吸收、轉運磷酸鹽及重金屬As 方面具有重要作用。除此之外，OsPT1 對水稻莖和根毛的伸長及分蘗等生長發育也具有調控作用［18］。但對于其在重金屬Cd 脅迫下的功能未知。

本研究通過對OsPT1的順式作用元件進行分析發現，該基因上游啟動子區含有與光、厭氧、茉莉酸甲酯等環境和激素相關的元件，同時還含有防御與應激反應的相關元件，推測其可能參與多種非生物脅迫［30］，并受到激素的調節作用。有研究表明，蘋果酸鹽轉運蛋白MdALMT14 具有絲氨酸磷酸化位點，可被磷酸化修飾以減少蘋果對Cd 的吸收［31］。本研究對OsPT1 磷酸化位點進行預測發現，其含有14 個絲氨酸磷酸化位點，推測OsPT1 依賴這些位點的磷酸化修飾來調控蛋白質活性，發揮生物學功能，介導對Cd 的吸收及轉運，但尚未有相關研究進行報道。此外，系統進化樹顯示OsPT1 與禾本科植物高粱SbPT1、玉米（Zea mays）ZmPT1、大麥（Hordeum vulgare）HvPT1 及小麥（Triticum aestivum）TaPT1親緣關系較近，表明同一科物種的PT1 蛋白同源性更高。雖無這些蛋白在響應重金屬脅迫過程中功能的相關報道，但對與OsPT1 親緣關系較遠的擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtPT1 研究發現，AtPT1 也參與對As 的吸收轉運［32］，表明在植物中PT1 功能較為保守。

為進一步探究OsPT1響應Cd 脅迫的表達特性及功能，本研究通過RT-qPCR 分析了在100 μmol/L濃度Cd 處理下OsPT1的相對表達量，并構建轉基因酵母研究OsPT1對酵母Cd 敏感性的影響。RTqPCR 分析發現，在Cd 處理1 h 和6 h 后，OsPT1在水稻所有組織中的表達量均上調，推測該基因可能參與水稻應對Cd 脅迫的調控機制。前人研究發現，OsPT1的表達與其功能相適應［33］，在添加As 后能顯著誘導OsPT1在根中的表達、降低在地上部分的表達，同時根中As 積累量顯著高于地上部分［19,21］。本研究發現，在Cd 處理后12 h，OsPT1在根中表達上調、在地上部分表達下調，與As 處理不同的表達模式也暗示OsPT1在水稻應對Cd 脅迫中所發揮的調控機制與As 不同，進一步推測OsPT1在水稻早期參與地上部分對Cd 的再分配，而在根部參與減少水稻對Cd 的吸收。此外，有研究表明，磷在植物中可通過提高Cd 脅迫下抗氧化酶的活性以增強植株對Cd 的耐受性［34］，OsPT1的表達在地上部上升，預示著在Cd 處理下水稻在地上部分積累了更多的磷，可能據此緩解Cd 的毒性；在Cd 處理后1 h 和6 h根中OsPT1的表達量無顯著變化，但在處理后12 h表達量卻下調，預示著水稻對磷酸鹽的吸收減少，這可能是Cd 導致植株生長緩慢的原因之一。前人研究發現，表達OsPT1基因的磷吸收缺陷型酵母能夠恢復其生長活性，表明OsPT1 在酵母中也發揮轉運磷的功能［18］。而在本研究中，表達OsPT1的酵母對Cd 的耐受性有所減弱，可能預示著OsPT1 也具有轉運Cd 的功能，通過將Cd 轉運至細胞內，降低了酵母菌株的生長活性。此外，最近一項研究發現，在對酵母補充磷酸鹽的過程中，Cd 對酵母的毒性顯著增強，且該研究認為這一結果可能由于產生了更多的活性氧造成的［35］。而本研究中轉OsPT1的酵母顯示出對Cd 的耐受性減弱，也可能由于OsPT1 轉運了更多的磷酸鹽至酵母細胞內，導致活性氧含量上升從而降低了酵母對Cd 的耐受性。目前已有多項研究表明，在施加外源磷的條件下，水稻植株積累了更多的Cd［36-38］，預示著水稻對Cd 與磷的轉運存在著協同作用，然而造成該現象的具體作用機制尚不明確。本研究結果表明，OsPT1可能參與水稻對Cd脅迫的響應機制，結合前人研究推測OsPT1 不僅參與對外源磷的吸收轉運，同時也在水稻吸收Cd 的過程中發揮重要的功能。然而，這些機制均有待進一步研究確認。

本研究對OsPT1響應重金屬Cd 脅迫的功能進行了生物信息學預測，并分析了Cd 脅迫下該基因的表達模式和功能，初步推測該基因可能在水稻抵御重金屬脅迫過程中發揮某種調控作用，為進一步研究其生物學功能提供參考，同時本研究也提出有關磷、Cd 共存時對水稻生長影響的新見解。但對于OsPT1在這些過程中具體的調控作用尚不明確，因此后續可通過構建水稻OsPT1的突變體植株和過表達植株，在Cd 脅迫處理下對水稻的表型特征及重金屬抵御相關的生物學功能進行分析，以進一步明確OsPT1在應對重金屬過程中的功能機制。

4 結論

克隆獲得OsPT1，其CDS 序列全長為1 584 bp，共編碼527 個氨基酸。OsPT1 蛋白質定位在細胞質膜上，與高粱SbPT1 親緣關系最近，分子量為57.46 kD，等電點為8.57，是一個穩定的疏水性蛋白質，含有許多與光、厭氧、茉莉酸甲酯等環境和激素響應相關的調控元件；含有34 處潛在的磷酸化位點；OsPT1可一定程度降低酵母細胞對Cd 的耐受性。