適配體識(shí)別-化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)福氏志賀菌

陳威風(fēng)，李曉雪，裴蘭梅，常惟丹，崔麗偉，潘春梅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州，450046)

志賀氏菌(Shigella)又稱痢疾桿菌，可以侵襲結(jié)腸上皮細(xì)胞，并可能通過穿透和破壞結(jié)腸上皮而導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)細(xì)菌性痢疾[1-2]。志賀氏菌根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)和生化反應(yīng)的不同可劃分為痢疾志賀菌(Shigelladysenteriae)、福氏志賀菌(Shigellaflexneri)、鮑氏志賀菌(Shigellaboydii)和宋內(nèi)氏志賀菌(Shigellasonnei)，福氏志賀菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸、耐鹽能力，并且可以在水和許多種類的食物中生存和生長(zhǎng)。由志賀氏菌引起的食源性疾病暴發(fā)通常是由于攝入了受污染的水和即食食物而導(dǎo)致的[3-4]，其臨床癥狀包括腹痛腹瀉、寒戰(zhàn)高熱以及反復(fù)驚厥等，嚴(yán)重時(shí)可危及生命[5]。在過去的幾十年里，志賀氏菌病的發(fā)生在不發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家都很流行[6]。

目前最常用于檢測(cè)志賀氏菌的方法是傳統(tǒng)培養(yǎng)法，利用傳統(tǒng)方法往往具有培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、需要5～7 d才能出結(jié)果等缺點(diǎn)，因此迫切需要一種簡(jiǎn)單、低成本、高選擇性、靈敏且準(zhǔn)確的福氏志賀菌檢測(cè)方法。除此之外，目前也有研究者建立了PCR法[7]﹑滾環(huán)擴(kuò)增法[8]﹑環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[9]﹑核酸等溫?cái)U(kuò)增方法[10]﹑免疫法和生物傳感器法[11-12]。盡管以上方法都能夠?qū)δ繕?biāo)菌進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，然而，有些方法卻仍需要較長(zhǎng)時(shí)間(超過10 h)來進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和DNA提取。此外，在檢測(cè)的過程中還會(huì)受到食品基質(zhì)的影響，從而降低檢測(cè)效果。化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence, CL)以其靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快、操作簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境無污染而廣泛應(yīng)用于食品安全[13]、藥理學(xué)[14]和病毒[15]等領(lǐng)域。磁分離技術(shù)主要用到的材料是磁性納米粒子(magnetic nanoparticles, MNPs)，該粒子是含有磁性金屬或具有獨(dú)特超順磁特性的金屬氧化物的納米粒子[16]，可與酶、抗體、DNA等多種功能分子結(jié)合。利用磁性納米粒子的超順磁性可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的快速分離、富集和純化，從而有效地縮短富集時(shí)間，消除樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，大大提高檢測(cè)效率。磁分離技術(shù)因其特異性好和效率高等特點(diǎn)而被應(yīng)用于生命科學(xué)、食品安全、化工及環(huán)境衛(wèi)生等[17～22]領(lǐng)域。

本研究以福氏志賀菌為靶標(biāo)，將福氏志賀菌適配體和磁性納米材料連接起來構(gòu)建捕獲探針，同時(shí)設(shè)計(jì)福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列，并將其與發(fā)光試劑魯米諾連接起來構(gòu)建信號(hào)探針，當(dāng)福氏志賀菌和信號(hào)探針同時(shí)存在時(shí)，它們會(huì)與體系中的捕獲探針進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，在磁場(chǎng)作用下，上清液中的信號(hào)探針越少，發(fā)光強(qiáng)度越低。上清液中的穩(wěn)態(tài)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的發(fā)光強(qiáng)度與福氏志賀菌濃度存在正相關(guān)。因此通過檢測(cè)上清液中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)福氏志賀菌的定量檢測(cè)。該方法可以從復(fù)雜的食品基質(zhì)中快速捕獲靶標(biāo)，無需對(duì)其進(jìn)行前富集處理，可以快速高效地對(duì)牛奶和豬肉中的福氏志賀菌進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AuCl4，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖，美國(guó)SIGMA公司；乙酸鈷、硅酸四乙酯，上海麥克林生化有限公司；三羥甲基氨基甲烷、親和素，北京索萊寶科技有限公司；三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)、魯米諾，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；戊二醛，山西益鑫泰生物科技有限公司。

福氏志賀菌適配體序列(FSZ-1)：5′-Biotin-CCTCATGTCGAACAGCAACACTGCAACACTGTATAGTCC-TGTGTGCCTTGAGCGTTTCTGAGCT-3′[23]，福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列(FSZ-2HH)：5′-HS-(CH2)6-AAACGCTCAAGGCACAC-3′。

1.2 儀器與設(shè)備

MP-EII電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，西安瑞邁分析儀器有限公司；DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；XFH-75CA電熱式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；HR/T16MM微量高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；BluStarB紫外可見分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；SPC150TEM透射電鏡，深圳市速普儀器有限公司。

1.3 魯米諾功能化花狀納米金的制備

魯米諾功能化花狀納米金(Luminol-AuNFs)是通過魯米諾和殼聚糖共同還原氯金酸制得。具體操作步驟如下：先稱取0.2 g殼聚糖溶于50 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的冰乙酸溶液中，然后取1 mL 0.1 mol/L魯米諾儲(chǔ)備液到上述溶液中，加水至95 mL，加熱至沸騰，同時(shí)劇烈攪拌，快速加入5 mL質(zhì)量濃度2 g/L的氯金酸儲(chǔ)備液，在沸騰狀態(tài)下保持30 min。最后將制得的產(chǎn)物冷卻至室溫，避光保存于4 ℃條件下，備用。

1.4 氨基化磁性納米Fe3O4的制備

按文獻(xiàn)[24]的方法合成氨基化磁性納米Fe3O4，具體操作步驟如下：首先稱取100 mg的納米Fe3O4，將其溶解于一定溶液[V(無水乙醇)∶V(水)=3∶1]中，加入6 mL氨水，于室溫下超聲5 min；然后加入2 mL正硅酸乙酯，置于搖床中孵育(200 r/min，6 h)；最后結(jié)合磁分離，同時(shí)用無水乙醇洗滌2次，即可得到硅烷化磁性納米Fe3O4；配制體積分?jǐn)?shù)95%～97%的乙醇溶液，取160 mL，然后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5～5.5；向上述溶液中添加8 mL硅烷偶聯(lián)劑，振蕩5 min后加入制備的硅烷化磁性納米Fe3O4進(jìn)行反應(yīng)(200 r/min，2 h)；最后結(jié)合磁分離，同時(shí)用無水乙醇洗滌2次，將其置于烘箱中(110 ℃，30 min)，取出后放入干燥皿中備用。

1.5 信號(hào)探針的構(gòu)建

信號(hào)探針是通過Luminol-AuNFs連接FSZ-2HH后得到的復(fù)合物。根據(jù)LI等[25]的方法，首先取5 mL Luminol-AuNFs離心，將沉淀的納米粒子分散于0.5 mL Tris-HCL緩沖液(30 mmol/L，pH 7.4)中得到Luminol-AuNFs膠體溶液。其次，將福氏志賀菌適配體的互補(bǔ)序列(150 μL，2.5 μmol/L)和TCEP(75 μL，2.5 μmol/L)在搖床中孵育30 min，然后加入到Luminol-AuNFs膠體溶液中，并置于搖床中振蕩孵育6 h，用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗多次，離心收集所得納米材料，最后將制得的信號(hào)探針分散于PBS緩沖液中。

1.6 捕獲探針的構(gòu)建

稱取10 mg氨基化磁性納米Fe3O4，用移液槍取5 mL PBS(pH 7.4)，超聲5 min，加入1.25 μL質(zhì)量濃度250 g/L戊二醛溶液，避光，孵育2 h(37 ℃，130 r/min)。磁分離，加入5 mL PBS，超聲5 min，棄上清液，如此重復(fù)操作2次，加入2.25 mL PBS，超聲5 min，加入750 μL 0.5 mg/mL親和素，超聲，避光孵育12 h(37 ℃，130 r/min)，磁分離(取上清液測(cè)紫外)，加5 mL PBS，清洗磁珠2次，加10 mL PBS，超聲5 min，制成親和素標(biāo)記的Fe3O4。棄上清液100 μL，加入100 μL 10 μmol/L適配體，然后孵育6 h(37 ℃，130 r/min)，磁分離(取上清液測(cè)紫外)，清洗3次，制得經(jīng)適配體修飾的磁性納米材料，即捕獲探針。

1.7 發(fā)光體系的構(gòu)建

將0.2 mL Luminol-AuNFs與0.5 mL發(fā)光緩沖溶液B混合，然后通過靜脈注射測(cè)定化學(xué)發(fā)光。向緩沖溶液A中加入0.1 mol/L的NaOH溶液、30 mmoL/L的Co2+和0.2 mol/L的H2O2溶液制得發(fā)光緩沖溶液B，緩沖溶液A是0.1 mol/L，pH 9.0的碳酸鹽緩沖液。

1.8 福氏志賀菌的檢測(cè)

首先，取0.2 mL捕獲探針和0.2 mL信號(hào)探針在37 ℃條件下孵育1 h，利用磁分離技術(shù)去除上清液，然后取一系列不同濃度福氏志賀菌0.2 mL于上述沉淀中繼續(xù)在37 ℃條件下孵育1 h。磁分離后取0.2 mL上清液于檢測(cè)池中，通過靜脈注射加入0.5 mL發(fā)光緩沖溶液B，記錄發(fā)光信號(hào)值。

1.9 選擇性實(shí)驗(yàn)

通過干擾實(shí)驗(yàn)對(duì)本研究方法的選擇性進(jìn)行測(cè)定，干擾細(xì)菌包括大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌、枯草芽孢桿菌。依照上述對(duì)福氏志賀菌的檢測(cè)方法對(duì)選取的其他致病菌進(jìn)行等濃度檢測(cè)，濃度均為500 CFU/mL，同時(shí)記錄體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化(ΔCL=CL-CL0，其中，CL表示體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的變化，CL表示當(dāng)體系中存在福氏志賀菌以及其他致病菌時(shí)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，CL0表示當(dāng)體系中不存在任何致病菌時(shí)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度)。

1.10 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證該方法在食品中應(yīng)用的可行性，本實(shí)驗(yàn)選取牛奶和生鮮豬肉進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。牛奶和生鮮豬肉樣本購(gòu)自當(dāng)?shù)爻校渲埔欢舛鹊母Ｊ现举R菌菌液(5.7×102CFU/mL)，分別吸取1～25 mL無菌奶樣品和25 g豬肉樣品，混合均勻后，利用以上建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 魯米諾功能化花狀納米金的表征

利用透射電鏡表征合成的魯米諾納米金復(fù)合材料，從圖1-a可以看出，合成材料均勻分布，粒徑大小均一，從圖1-b可以看出單一納米材料呈現(xiàn)花狀結(jié)構(gòu)，平均粒徑約為50 nm。花狀結(jié)構(gòu)可以有效地增大納米材料表面積，其形成機(jī)制如下：魯米諾和殼聚糖作為氯金酸的共還原劑，與單一還原劑相比，具有更強(qiáng)的還原性，在制備初期，氯金酸被還原成大量的納米點(diǎn)，進(jìn)而形成花狀的金納米顆粒。殼聚糖的用量決定了Luminol-AuNFs顆粒的粒徑，殼聚糖用量越少，合成的物質(zhì)粒徑越大，反之同理。

a-×5 000；b-×100 000圖1 魯米諾功能化花狀納米金在不同放大倍數(shù)下的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy of Luminol functionalized flower-like gold nanoparticles at different magnification

2.2 磁性納米Fe3O4及氨基化磁性納米Fe3O4的表征

圖2是磁性納米粒子的X-射線衍射(X-ray diffraction, XRD)表征圖。在20°～70°呈現(xiàn)不同強(qiáng)度的晶體衍射峰，結(jié)果表明，產(chǎn)物具有良好的結(jié)晶度，即產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為尖晶石結(jié)構(gòu)。圖2-a特征峰與Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)卡(JCPDS 65-3107)表示的衍射峰完全一致，6個(gè)特征峰分別為2θ=30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57.0°、62.6°，晶面指數(shù)分別為220、311、400、422、511、440。從圖中可以看出，b特征峰與a特征峰大致相同，只有衍射峰的寬度不太相同，這可能與粒徑不同相關(guān)。因此，納米粒子在小范圍內(nèi)具有細(xì)觀有序結(jié)構(gòu)，在氨基化之后也不能改變Fe3O4的晶型。

a-納米Fe3O4；b-氨基化納米Fe3O4圖2 磁性納米Fe3O4的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction of magnetic nanometer ferric oxide

2.3 捕獲探針和信號(hào)探針的表征

圖3-a為親和素修飾前后的氨基化磁性納米Fe3O4的紫外光譜圖。圖3-a表示未經(jīng)修飾的氨基化磁性納米Fe3O4的吸光度，而圖3-b表示修飾后的氨基化磁性納米Fe3O4，在280 nm處吸光度值有明顯下降，表明親和素與氨基化磁性納米Fe3O4成功連接。如圖3-b所示，經(jīng)對(duì)適配體原液與親和素化的氨基化磁性納米Fe3O4孵育前后的上清液進(jìn)行吸光度值測(cè)定后，發(fā)現(xiàn)在260 nm處孵育后的吸光度(b)較孵育前的吸光度(a)明顯下降，說明適配體序列已連接在親和素修飾后的氨基化磁性納米Fe3O4的表面，即成功制備了捕獲探針。

圖3 親和素原液(a)和氨基化磁性納米Fe3O4與親和素反應(yīng)后上清液(b)的紫外光譜圖(A)；福氏志賀菌適配體原液(a)和親和素化磁性納米Fe3O4與福氏志賀菌適配體反應(yīng)后上清液(b)的紫外光譜圖(B)Fig.3 UV spectrogram of the supernatant (b) after the reaction of avidin stock solution (a) and amininated magnetic nano-Fe3O4 with avidin (A);Ultraviolet spectrogram of S. flexneri aptamer raw solution (a) and avidinized magnetic nano-Fe3O4supernatant (b) after reaction with S. flexneri aptamer (B)

信號(hào)探針是由巰基化的福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列與魯米諾功能化花狀納米金連接而成的。巰基化的核酸適配體互補(bǔ)序列可以通過Au—S鍵與納米金進(jìn)行連接，為了提高連接效率而加入TCEP，TCEP的功能是損壞位于巰基化核酸適配體互補(bǔ)序列內(nèi)部和2條核苷酸序列之間的S—S共價(jià)鍵，以便巰基化的核酸適配體互補(bǔ)序列與納米金形成Au—S鍵。

圖4是巰基化的核酸適配體互補(bǔ)序列修飾前后的魯米諾功能化花狀納米金的紫外光譜圖，與未經(jīng)修飾的魯米諾功能化花狀納米金對(duì)比，經(jīng)適配體互補(bǔ)序列修飾的魯米諾功能化花狀納米金的上清液在260 nm處的吸光度值明顯下降，表明適配體的互補(bǔ)序列已經(jīng)連接在魯米諾功能化花狀納米金的表面，進(jìn)而證明信號(hào)探針制備成功。

圖4 福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列原液(a)和魯米諾功能化花狀納米金與互補(bǔ)序列反應(yīng)后上清液(b)的紫外光譜圖Fig.4 UV spectrogram of the original solution (a) of the S. flexneri aptamer complementary sequence and the supernatant solution (b) of the Luminol functionalized flower-like gold nanoparticles after the reaction with the complementary sequence

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

通過單變量實(shí)驗(yàn)對(duì)影響化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的適配體的互補(bǔ)序列與魯米諾功能化花狀納米金的孵育時(shí)間、H2O2濃度、緩沖溶液的pH、Co2+的濃度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果如圖5所示。

a-孵育時(shí)間；b-緩沖液中H2O2濃度；c-緩沖液pH；d-Co2+濃度圖5 福氏志賀菌適配體互補(bǔ)序列與魯米諾功能化花狀納米金的孵育時(shí)間、緩沖液中H2O2濃度、緩沖液pH以及Co2+濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of inincubation time of S. flexneri aptamer complementary sequence and luminol functionalized flower-like gold nanoparticles, H2O2 concentration, buffer pH and CO2 + concentration on chemiluminescence intensity

福氏志賀菌適配體的互補(bǔ)序列和福氏志賀菌會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合福氏志賀菌的核酸適配體，所以信號(hào)探針上的適配體互補(bǔ)序列與Luminol-AuNFs粒子之間的孵育時(shí)間在檢測(cè)過程中是非常重要的。如圖5-a所示，在待測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)，紫外吸光度值的差值隨著時(shí)間的增加而減小，待出現(xiàn)最大值后再次減小。因此，本實(shí)驗(yàn)中互補(bǔ)序列和Luminol-AuNFs的最佳孵育時(shí)間為6 h。除此之外，對(duì)H2O2濃度、緩沖液的pH和Co2+濃度進(jìn)行了一系列優(yōu)化，由圖5-b～圖5-d可知當(dāng)H2O2的濃度為0.2 mol/L、發(fā)光緩沖液的pH為9.0時(shí)，Co2+濃度為30 mmol/L時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度分別達(dá)到最大值。因此選擇優(yōu)化后的孵育時(shí)間、Co2+濃度、過氧化氫濃度和pH作為該實(shí)驗(yàn)方法的最佳反應(yīng)條件。

2.5 檢測(cè)性能分析

當(dāng)體系中不存在福氏志賀菌時(shí)，捕獲探針只能和信號(hào)探針結(jié)合，此時(shí)體系的化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最小值；當(dāng)體系中存在福氏志賀菌時(shí)，福氏志賀菌和信號(hào)探針會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合捕獲探針，此時(shí)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度升高。選取最佳的實(shí)驗(yàn)條件，配制一系列不同濃度的福氏志賀菌菌液，在本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的體系下測(cè)定化學(xué)發(fā)光，從而得到不同濃度福氏志賀菌的化學(xué)發(fā)光光譜圖和線性曲線圖(圖6)。

圖6 福氏志賀菌濃度和電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.6 Correlation between the concentration of S. flexneri and chemiluminescence intensity

該實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與福氏志賀菌的濃度呈正相關(guān)，同時(shí)在福氏志賀菌濃度為2.6×10～2.6×105CFU/mL具有良好的線性關(guān)系。其線性方程為Y=68.480 02+272.065 6X，R2=0.995 02，檢測(cè)限為12 CFU/mL。LUO等[26]開發(fā)了一種用于檢測(cè)糞便和血液中志賀菌的免疫傳感器，檢出限可以達(dá)到21和18 CFU/mL。FENG等[27]開發(fā)一種適用于福氏志賀菌的納米金比色法，檢出限達(dá)到80 CFU/mL。與以上2種方法相比，本研究建立的方法具有更低的檢出限值。

2.6 選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖7所示，當(dāng)福氏志賀菌存在時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化較大，說明捕獲探針上連接的適配體可以與福氏志賀菌發(fā)生特異性結(jié)合，從而使得本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的適配體傳感器對(duì)福氏志賀菌呈現(xiàn)良好的特異性；而當(dāng)其他致病菌存在時(shí)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化不明顯，即表明捕獲探針上連接的適配體不能與它們發(fā)生特異性結(jié)合。該結(jié)果說明本文構(gòu)建的檢測(cè)方法受到其他致病菌的干擾較小，對(duì)福氏志賀菌呈現(xiàn)較高的特異性。

圖7 不同類型細(xì)菌對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值的影響Fig.7 Effect of different types of bacteria on luminescence intensity

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證該方法的可行性，利用該方法對(duì)市售牛奶和豬肉進(jìn)行加標(biāo)檢測(cè)。如表1所示，福氏志賀菌的加標(biāo)回收率在95.4%～114.4%，相對(duì)偏差(n=3)在1.4%～3.9%，說明本方法具有良好的準(zhǔn)確性。

表1 本方法對(duì)牛奶和豬肉中福氏志賀菌加標(biāo)回收檢測(cè)結(jié)果(n=3)Table 1 Recovery of S. flexneri in milk and pork (n=3) using this method

3 結(jié)論

本研究以納米Fe3O4為原料制得氨基化磁性納米Fe3O4，以魯米諾和殼聚糖作為共還原劑對(duì)氯金酸進(jìn)行還原合成魯米諾功能化花狀納米金。在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建用于檢測(cè)福氏志賀菌的核酸適配體傳感器，呈現(xiàn)良好的特異性。利用本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的檢測(cè)方法對(duì)市售牛奶和豬肉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其加標(biāo)回收率在95.4%～114.4%，相對(duì)偏差(n=3)在1.4%～3.9%，本方法的建立為今后食源性致病菌的快速檢測(cè)提供了新的思路。