兩種常見缺失型β-珠蛋白生成障礙性貧血的基因型及血液學(xué)表型特征*

鞠愛萍，付曉彤，劉艷霞，林 鏗，李 娜，李熹翀

1.廣東省廣州市花都區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510800；2.南昌大學(xué)瑪麗女王學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330031；3.廣東省廣州市花都區(qū)炭步衛(wèi)生院護(hù)理部，廣東廣州 510800

珠蛋白生成障礙性貧血即地中海貧血(簡(jiǎn)稱“地貧”)是一種常染色體單基因遺傳病，主要是由于α和β-珠蛋白鏈不平衡所致，以α-地貧和β-地貧最常見，其中重型β-地貧為致死、致殘性疾病，但目前還沒有完全治愈的方法[1]。β-地貧主要(95%)是由β-珠蛋白基因點(diǎn)突變引起，少部分(5%)是由β-珠蛋白基因缺失引起，我國目前已報(bào)道了5種缺失型β-地貧，均為大片段缺失，包括中國型Chinese、廣州型Gantonese、云南型Yunnanese、東南亞型S.E.Asian、臺(tái)灣型Taiwanese[2]；在我國南方地區(qū)缺失型β-地貧主要以中國型Chinese、東南亞型S.E.Asian多見，均為致病性突變，并且以血紅蛋白(Hb)F水平明顯升高為特點(diǎn)[2]。花都區(qū)位于廣州北部地區(qū)，屬于地貧高發(fā)區(qū)，常見的α-地貧和β-地貧基因型分布和血液學(xué)表型特征已經(jīng)有系統(tǒng)的報(bào)道[3-4]，但是對(duì)花都區(qū)育齡人群中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和東南亞型遺傳性持續(xù)性胎兒血紅蛋白增高癥(SEA-HPFH)兩種缺失型β-地貧的報(bào)道資料較少。本研究通過對(duì)廣州市花都區(qū)育齡人群中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH進(jìn)行回顧性總結(jié)和分析，以了解花都區(qū)育齡人群中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH的基因型分布、血液學(xué)表型特征和人群攜帶等情況，為這兩種缺失型β-地貧的鑒別診斷、遺傳咨詢及地貧預(yù)防和控制提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至 2021年7月在廣州市花都區(qū)婦幼保健院參與地貧基因檢測(cè)的18 848例受檢者中診斷為中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH共27例地貧攜帶者作為研究對(duì)象，包括中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧7例，SEA-HPFH 20例；均為廣州市花都區(qū)戶籍；年齡21～39歲；男11例，女16例。納入標(biāo)準(zhǔn)：平均紅細(xì)胞體積(MCV)<82 fL和/或平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)<27 pg、HbF≥5%、HbA2水平正常或升高者，經(jīng)過基因檢測(cè)為中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠、范可尼貧血、骨髓惡性腫瘤、非缺失型HPFH及其他染色體上基因突變導(dǎo)致的HbF水平增高者。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)廣州市花都區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 選用Sysmex XN-550全自動(dòng)血液分析儀(日本Sysmex公司)，Capillary2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀(法國Sebia公司)，HB-2012A醫(yī)用核酸分子雜交儀(廣東凱普生物科技股份有限公司)等設(shè)備。α-地貧和β-地貧基因檢測(cè)試劑盒[聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)+導(dǎo)流雜交法](廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1血液學(xué)參數(shù)檢測(cè) 采用乙二胺四乙酸抗凝管采集研究對(duì)象靜脈血2 mL，采用Sysmex XN-550全自動(dòng)血液分析儀和Capillary2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀，在確定儀器運(yùn)行狀態(tài)良好，批次實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控在控后，分別對(duì)樣本進(jìn)行血常規(guī)和Hb電泳檢測(cè)，主要血液學(xué)參數(shù)有Hb(正常參考值范圍男：120～180 g/L,女：110～170 g/L)、MCV(正常參考值范圍：82～100 fL)、MCH(正常參考值范圍：27～34 pg)，對(duì)于MCV<82 fL和/或MCH<27 pg的樣本，Hb電泳分析主要檢測(cè)HbA(正常參考值范圍：94.5%～97.5%)、HbA2(正常參考值范圍：2.5%～3.5%)、HbF(正常參考值范圍：0.0%～2.5%)。

1.3.2常規(guī)地貧基因型檢測(cè) 采用廣東潮州凱普公司生產(chǎn)的地貧基因試劑，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)批次陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控在控，采用跨越斷裂點(diǎn)(Gap)-PCR+導(dǎo)流雜交法檢測(cè)中國人3 種缺失型 α-地貧(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3 種突變型 α-地貧(CS、QS、WS)和17個(gè)位點(diǎn)的19種突變型β-地貧。

1.3.3中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH檢測(cè) 對(duì)于MCV<82 fL和/或MCH<27 pg、HbF≥5%的樣本，而常規(guī)17種β-地貧檢測(cè)為陰性者，提示此樣本可能存在缺失型β-地貧基因型或尚未發(fā)現(xiàn)的新發(fā)突變型，采用Gap-PCR在中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH缺失范圍的上、下游分別設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性9 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 60 s,72 ℃延伸7 min，擴(kuò)增完成后采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH基因型檢測(cè)結(jié)果 對(duì)于MCV<82 fL和/或MCH<27 pg、HbF≥5%，而常規(guī)17種β-地貧檢測(cè)為陰性的樣本進(jìn)行中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH檢測(cè)，采用Gap-PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，得到中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧500 bp擴(kuò)增片段和SEA-HPFH 350 bp擴(kuò)增片段，檢測(cè)結(jié)果見圖1。

注：M為Marker；N為陰性對(duì)照；SA為SEA-HPFH陽性對(duì)照；CN為中國型 Gγ+(Aγδβ)0地貧陽性對(duì)照；S1為中國型 Gγ+(Aγδβ)0地貧陽性樣本；S2為SEA-HPFH陽性樣本。圖1 中國型 Gγ+(Aγδβ)0地貧、SEA-HPFH基因型 檢測(cè)電泳圖

2.2花都區(qū)育齡人群中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH基因型分布及其血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較 在18 848例受檢者中檢出中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH共27例，總檢出率為0.14%(27/18 848)，中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧檢出率為0.04%(7/18 848)，其中復(fù)合--SEA/αα 1例；SEA-HPFH檢出率為0.11%(20/18 848)，其中復(fù)合--SEA/αα 1例，αWSα/αα復(fù)合SEA-HPFH /β-28 1例。中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧7例，構(gòu)成比為25.93%(7/27)；SEA-HPFH 20例，構(gòu)成比為74.07%(20/27)。中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH均呈現(xiàn)小細(xì)胞低色素性貧血，HbF水平均明顯升高，兩種常見缺失型β-地貧的基因型分布情況與血液學(xué)表型特征分析結(jié)果見表1。

表1 花都區(qū)育齡人群兩種缺失型β-地貧的基因型分布情況與血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較

2.3花都區(qū)育齡人群?jiǎn)渭冎袊虶γ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較 對(duì)6例單純中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧雜合子(1例中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧復(fù)合--SEA/αα不納入其中) 和18例單純SEA-HPFH雜合子(1例復(fù)合--SEA/αα、1例αWSα/αα復(fù)合SEA-HPFH/β-28不納入其中) 血液學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，兩種缺失型β-地貧的雜合子血液學(xué)參數(shù)除Hb外，MCV、MCH、HbA2、HbA、HbF水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 花都區(qū)育齡人群?jiǎn)渭冎袊虶γ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較

3 討 論

中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧最初由MANN等[5]于20世紀(jì)70年代報(bào)道，是一種基因缺失突變導(dǎo)致的δβ-地貧，其缺失范圍包括β-珠蛋白基因簇Aγ、Ψβ、δ和β-基因及3′-HS-1區(qū)域，缺失長度為78.9 kb[2]。SEA-HPFH是一種中國人群常見的、以高水平HbF為表型的β-地貧基因缺失突變，其缺失范圍為β-珠蛋白基因簇β-基因和3′-HS-1區(qū)域，缺失長度為27.0 kb[2]。β-珠蛋白基因簇定位于11號(hào)染色體11p15.3位點(diǎn)，類β-珠蛋白基因簇的大片段缺失會(huì)導(dǎo)致δβ-地貧或HPFH。正常情況下，γ-珠蛋白在孕5周時(shí)在肝臟開始表達(dá)，在出生前后關(guān)閉，HbF水平迅速下降，HbF(α2γ2)在2歲時(shí)不超過1%[2]。目前對(duì)于β-缺失導(dǎo)致HbF水平升高的分子機(jī)制還不完全清晰，有文獻(xiàn)報(bào)道可能是β基因簇上參與基因表達(dá)調(diào)控的元件出現(xiàn)異常，從而影響γ基因的開關(guān)轉(zhuǎn)換，使γ基因替代β基因功能，導(dǎo)致患兒HbF高水平一直持續(xù)至成年，在一定程度上緩解了α與β肽鏈的不平衡，從而減輕了臨床癥狀[6]。

本研究結(jié)果顯示，花都區(qū)育齡人群18 848例樣本中檢出中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH共27例，其中中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧7例，構(gòu)成比為25.93%，SEA-HPFH 20例，構(gòu)成比為74.07%。總檢出率為0.14%，中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧檢出率為0.04%，SEA-HPFH檢出率為0.11%，高于深圳地區(qū)人群的0.026%和0.025%[7]，這可能與花都區(qū)以本地人群為主，而深圳地區(qū)外來人群較多，流動(dòng)人口群體占比較大有關(guān)。花都區(qū)中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧檢出率(0.04%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于惠州地區(qū)的0.14%[8]，同時(shí)也低于廣西的0.07%[9]，花都區(qū)SEA-HPFH檢出率為0.11%，稍低于惠州地區(qū)的0.16%[10]，可能與惠州以本地區(qū)客家人居多有關(guān)，充分說明這兩種缺失型β-地貧具有明顯的地域和人群異質(zhì)性。花都區(qū)中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧雜合子MCV、MCH水平明顯降低，為典型的小細(xì)胞低色素性貧血，HbA2水平降低或正常，HbF水平明顯升高；SEA-HPFH輕度或無貧血表現(xiàn)，MCV、MCH水平僅輕度降低，HbA2水平升高，HbF水平則明顯升高，HbF升高比中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧更加明顯，可見中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧比SEA-HPFH臨床表型更重一些，二者除Hb外，血液學(xué)參數(shù)MCV、MCH、HbA2、HbA、HbF水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[11-13]。中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH雖然某些血液學(xué)指標(biāo)有差異，但是僅依靠臨床表型和血液學(xué)參數(shù)要將其區(qū)分開，仍有一定的難度，還需要依賴基因診斷才能明確具體的基因型別。

本研究檢測(cè)到1例中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧復(fù)合--SEA/αα樣本，MCV、MCH水平均降低，Hb和HbA2水平正常，HbF水平較單純中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧有所降低，為6.10%，所以其臨床表型較單純中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧更輕，原因與α、β珠蛋白基因同時(shí)缺失，使α、β鏈合成趨于相對(duì)平衡有關(guān)。另檢出1例SEA-HPFH復(fù)合--SEA/αα基因型，臨床表型與單純SEA-HPFH相近，HbA2水平下降至正常范圍，HbF水平則高達(dá)26.00%。有報(bào)道稱SEA-HPFH合并--SEA/αα，其HbA2水平仍明顯升高，而HbF水平與單純SEA-HPFH的HbF水平差異不大[7]。此外檢出1例αWSα/αα復(fù)合SEA-HPFH/β-28，其MCV、MCH、Hb水平均明顯降低，HbA2水平稍升高，為3.80%，而其HbF水平明顯升高，為77.40%，有文獻(xiàn)報(bào)道SEA-HPFH復(fù)合CD41-42、CD71-72時(shí)HbF水平則明顯升高，達(dá)90.00%以上，僅有輕度貧血癥狀[12]。另有文獻(xiàn)報(bào)道SEA-HPFH合并不同類型的β-地貧基因型時(shí)，臨床表型可為輕型、中間型、重型地貧[14]。本研究中未檢出中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧合并常規(guī)β-地貧基因型，但有報(bào)道稱中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧合并CD17時(shí)為重型貧血癥狀[12]。當(dāng)中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧、SEA-HPFH復(fù)合其他類型地貧時(shí)，其血液學(xué)參數(shù)相應(yīng)會(huì)有所改變，具體血液學(xué)參數(shù)和臨床表型情況要以復(fù)合的基因類型和地區(qū)人群來決定，這與相關(guān)報(bào)道一致[7,11-12]。而單純中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH與復(fù)合其他基因類型的樣本間差異是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，還需要今后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來驗(yàn)證。

由于目前常規(guī)地貧檢測(cè)范圍不包括中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧和SEA-HPFH基因型，作為實(shí)驗(yàn)室人員，在常規(guī)地貧檢測(cè)為陰性但血液學(xué)參數(shù)MCV、MCH水平降低，尤其是HbF≥5%時(shí)，要考慮到樣本可能存在缺失型β-地貧的情況，必須采用相應(yīng)的技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)；對(duì)于育齡夫婦一方為常規(guī)β-地貧，另外一方為中國型Gγ+(Aγδβ)0地貧或SEA-HPFH時(shí)，有生育中、重型地貧患兒的可能[15]，對(duì)于此類人群仍有進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷的必要，以防漏診。