防脫育發(fā)精華液對雄激素性脫毛大鼠局部皮膚睪酮、雙氫睪酮、肝細(xì)胞生長因子水平的影響

譚素芳，程 曉，徐翠萍，鐘 昕，周 琦，劉朝圣*

1.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖南 株洲 412012；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院，湖南 株洲 412000

脫發(fā)是皮膚科中的常見病、多發(fā)病。 其中，雄激素性脫發(fā)，又名男性型脫發(fā)，發(fā)病率占脫發(fā)的90%，是目前導(dǎo)致脫發(fā)的第一大原因，具有反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈的特點。臨床主要表現(xiàn)為前額及兩側(cè)鬢角發(fā)際線上行及頭頂毛發(fā)稀疏，常伴油膩、脫屑、瘙癢等癥[1-3]，具有反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈的特點[4]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為精血為頭發(fā)化生之源，精血不足、肝腎虧虛則無以濡養(yǎng)肌膚毛發(fā)，或長期精神壓力過大，肝郁氣滯，氣行不暢，進而氣滯血瘀，發(fā)失所養(yǎng)。中藥復(fù)方具有療效確切、不良反應(yīng)少的優(yōu)點。從中藥中篩選防治雄激素性脫發(fā)的處方，是防治雄激素性脫發(fā)藥物開發(fā)的一種新嘗試。 防脫育發(fā)精華液是廣東芙妍化妝品公司歷時20 余年研發(fā)的一款用于治療雄激素性脫發(fā)的外用洗劑，由《本草綱目》七寶美髯丹加減化裁研制而成，主要由女貞子、何首烏、菟絲子、側(cè)柏葉、苦參、艾葉、川芎、花椒等中藥組成，具有固發(fā)防脫、祛風(fēng)止癢的功能。 本課題組前期研究顯示，防脫育發(fā)液在控制頭癢和頭油癥狀、減少脫發(fā)數(shù)量及促進新發(fā)生長方面臨床療效確切，且在研究過程中未發(fā)生不良反應(yīng)[5]。

本研究以雄激素性脫毛大鼠模型為實驗載體，觀察大鼠毛發(fā)生長及睪酮（testosterone, T）、雙氫睪酮（dihydrotestosterone, DHT）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor, HGF）表達的變化，探討其作用機制，為臨床應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

6 周齡雄性SPF 級SD 大鼠45 只，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK（湘）2020-0010。 飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)東塘校區(qū)SPF 級動物實驗中心，嚴(yán)格按照動物倫理學(xué)要求善待動物（動物實驗倫理審批號：ZYFY20220513-40）。

1.2 主要藥物與試劑

防脫育發(fā)精華液（廣東芙妍化妝品有限公司，批號：20210221）；米諾地爾酊（浙江萬晟藥業(yè)有限公司，批號：20210927）；丙酸睪酮（上海凜恩科技發(fā)展有限公司，批號：R002673）；大鼠T 試劑盒（批號：MM-0577R1）、大鼠DHT 試劑盒（批號：MM-0532R1）均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：EBC-K318-M）；HGF（北京安諾倫生物科技有限公司，批號：26881-1-ap）。

1.3 主要儀器

低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司，型號：5424R）；電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司，型號：PX224ZH）；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號：Chemi DocTMXRS+）；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號：Tanon-5200）。

2 方法

2.1 動物分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，用Excel 軟件隨機分為空白組、對照組、模型組、米諾地爾酊組、防脫育發(fā)液精華組，每組各9 只。

2.2 動物造模及給藥

將丙酸睪酮用花生油進行稀釋，待混勻后配成濃度為5 mg/mL 的溶液。參照文獻[6-8]構(gòu)建動物模型，空白組無干預(yù)措施，對照組皮下注射生理鹽水外，其他組皮下多點注射5 mg/kg 的丙酸睪酮，每天上午注射1 次，連續(xù)35 d。 大鼠頸背部觀察區(qū)毛發(fā)出現(xiàn)脫落、稀疏現(xiàn)象，提示造模成功。 由于本實驗周期較長，動物局部雄激素受體具有可逆性[8]，因此，造模成功后需持續(xù)皮下注射丙酸睪酮，此后丙酸睪酮的注射劑量減半[9-10]。

造模的同時進行藥物干預(yù)，皮下注射造模30 min后，將藥物涂于脫毛實驗觀察區(qū)內(nèi)。 給藥劑量參照《實驗動物學(xué)基礎(chǔ)與技術(shù)》[11]，通過人與大鼠體表面積比換算出大鼠的用藥量。 空白組和模型組涂賦型劑（生理鹽水），其余組予相應(yīng)的治療藥物，每天給藥1 次，連續(xù)35 d。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 一般狀態(tài)觀察 每天觀察大鼠的精神狀態(tài)、毛色、脫毛、體質(zhì)量、飲食量、二便等情況。

2.3.2 ELISA 法測定大鼠局部皮膚組織中T、DHT含量 實驗第36 天后， 將大鼠麻醉，75%乙醇局部消毒，鑷子捏起大鼠背部皮膚，取1 g 新鮮皮膚組織，加入9 g PBS 緩沖液，勻漿離心，收集上清液，按照相應(yīng)試劑盒說明，用ELISA 法測定皮膚中的T、DHT含量。

2.3.3 免疫組化及Western blot 檢測局部皮膚組織中HGF 蛋白表達 實驗第36 天后，將大鼠麻醉后取新鮮皮膚組織固定，按照免疫組化流程，經(jīng)石蠟切片、抗原修復(fù)、淋洗、封閉、敷一抗、敷二抗、顯色復(fù)染等操作，對HGF 的蛋白表達水平進行測定。 另一部分新鮮皮膚組織采用BCA 測定法，提取蛋白并檢測濃度、制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、曝光等流程，檢測局部皮膚組織中HGF 蛋白相對表達量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以“±s”表示，當(dāng)資料滿足正態(tài)分布和方差齊性時，采用完全隨機設(shè)計多組ANOVA 分析，并采用LSD-t法進行多重比較，否則采用Kruskal-wallis H 檢驗；體質(zhì)量變化情況采用重復(fù)測量方差分析。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài)

SD 大鼠毛發(fā)豐富，喜舔舐毛發(fā)，實驗過程中空白組觀察區(qū)毛發(fā)呈現(xiàn)出濃密、潔白、柔順，未見明顯脫落；對照組基本不見裸露皮膚；模型組、米諾地爾酊組、防脫育發(fā)精華液組在連續(xù)皮下注射丙酸睪酮3周后，毛發(fā)失去光澤，顏色變灰暗，于4 周后逐漸出現(xiàn)毛發(fā)稀疏、脫落現(xiàn)象，存留的毛發(fā)變得易油膩、纖細(xì)、質(zhì)脆，偶見小塊裸露皮膚，毛發(fā)脫落于第5 周尤為明顯。實驗過程中各組間體質(zhì)量變化比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖1、表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較（±s，n=9）

組別空白組對照組模型組米諾地爾酊組防脫育發(fā)精華液組第1 周248.88±6.75 245.88±6.62 258.27±7.79 255.46±12.41 246.15±13.04第2 周310.98±6.78 306.81±11.47 318.56±14.51 312.32±19.19 308.73±18.95第3 周324.05±11.29 324.61±10.59 339.18±19.57 339.67±18.61 339.67±18.61第4 周353.44±20.88 349.56±18.37 356.89±19.37 355.44±21.70 346.56±24.99第5 周383.56±29.90 380.78±33.72 382.78±27.19 390.67±27.16 361.67±50.78

圖1 各組大鼠局部毛發(fā)狀態(tài)比較

3.2 各組大鼠局部皮膚組織中T、DHT 含量

與空白組比較，模型組T、DHT 含量均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。 對照組與空白組間T、DHT 含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 與模型組比較，米諾地爾酊組、防脫育發(fā)精華液組T、DHT 含量均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。 與米諾地爾酊組比較，防脫育發(fā)精華液組DHT 含量明顯降低（P＜0.05）。米諾地爾酊組與防脫育發(fā)精華液組間T 含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠局部皮膚組織中T、DHT 含量比較（±s，n=9）

表2 各組大鼠局部皮膚組織中T、DHT 含量比較（±s，n=9）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與米諾地爾酊組比較，ΔP＜0.05。

組別空白組對照組模型組米諾地爾酊組防脫育發(fā)精華液組T/（pg·mL-1）154.784±4.276 160.132±16.403 203.012±15.851**167.487±10.173##159.842±10.685##DHT/（nmol·L-1）5.802±0.277 5.909±0.272 6.592±0.524*6.170±0.670#5.635±0.322##Δ

3.3 各組大鼠局部皮膚組織中HGF 蛋白表達情況

免疫組化結(jié)果顯示：與空白組及對照組比較，模型組HGF 蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.05)。 空白組與對照組組間HGF 蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 與模型組比較，防脫育發(fā)精華液組HGF蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05）。 米諾地爾酊組與防脫育發(fā)精華液組間HGF 蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖2、表3。

圖2 各組大鼠皮膚組織HGF 蛋白表達免疫組化圖（×10）

表3 各組大鼠皮膚組織HGF 蛋白表達水平比較（免疫組化，±s，n=9）

表3 各組大鼠皮膚組織HGF 蛋白表達水平比較（免疫組化，±s，n=9）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與對照組組比較，&P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

HGF 5.086±2.026 6.633±1.691 2.599±0.326*&3.583±0.446 5.343±1.155#組別空白組對照組模型組米諾地爾酊組防脫育發(fā)精華液組

Western blot 結(jié)果顯示：與空白組比較，對照組HGF 蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），模型組HGF 蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）。 與對照組比較，模型組HGF 蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，米諾地爾酊組、防脫育發(fā)精華液組HGF 蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）。米諾地爾酊組與防脫育發(fā)精華液組間HGF 蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖3、表4。

圖3 各組大鼠HGF 蛋白表達電泳圖

表4 各組大鼠皮膚組織HGF 蛋白相對表達量比較（±s，n=9）

表4 各組大鼠皮膚組織HGF 蛋白相對表達量比較（±s，n=9）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與對照組組比較，&P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

HGF 0.150±0.027 0.229±0.053*0.079±0.013*&0.163±0.047#0.191±0.029#組別空白組對照組模型組米諾地爾酊組防脫育發(fā)精華液組

4 討論

雄激素性脫發(fā)是一種以進行性的毛囊微小化為主要病理表現(xiàn)的毛發(fā)進行性減少的疾病，其發(fā)病機制主要與遺傳、性激素、皮脂腺分泌、局部微環(huán)境、精神壓力、飲食等因素有關(guān)[11-12]。 皮下注射丙酸睪酮注射液是通過局部皮膚區(qū)域注射游離T，經(jīng)5α-還原酶作用轉(zhuǎn)化為活性更高的DHT，DHT 隨即與其受體結(jié)合形成雄激素-受體復(fù)合物，逐漸使毛囊微小化[13]，最終導(dǎo)致脫發(fā)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療脫發(fā)的常用方法有激素調(diào)節(jié)劑、生物反應(yīng)學(xué)調(diào)節(jié)劑、光化學(xué)療法、手術(shù)移植等，有一定的治療效果，但有不同程度的不良反應(yīng)[14-15]。

防脫育發(fā)精華液由女貞子、何首烏、菟絲子、側(cè)柏葉、苦參、艾葉、川芎、花椒等中藥組成。 方中制何首烏性微溫、味甘澀，歸肝、腎經(jīng)，發(fā)揮補益肝腎精血，固腎澀精烏須之功，為君藥。 菟絲子、女貞子、靈芝共為臣藥，菟絲子歸肝、脾、腎經(jīng)，補腎填精；女貞子歸肝、肺、腎三經(jīng)，補肝腎、明目烏發(fā)；靈芝歸心、肺、肝、腎經(jīng)，補氣安神、扶正固本。側(cè)柏葉涼血、生發(fā)黑發(fā)，歸肺、肝、大腸經(jīng)；苦參歸心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，清熱燥濕殺蟲、涼血、生發(fā)黑發(fā)；血中之氣藥川芎歸肝、膽經(jīng)，行氣活血止痛，艾葉歸肝、脾、腎經(jīng)，溫經(jīng)通絡(luò)、散寒止痛，共為佐藥。花椒歸脾、胃、腎經(jīng)，辛香走竄，溫中散寒除濕，載藥達毛竅，為使藥。 以上諸藥相輔相成，共奏固發(fā)防脫、祛風(fēng)止癢之功。

本研究實驗結(jié)果表明防脫育發(fā)精華液對雄激素性脫毛大鼠毛發(fā)脫落具有改善作用，主要表現(xiàn)在較模型組大鼠而言，防脫育發(fā)精華液組大鼠毛發(fā)油膩程度減輕，毛干差異小，毛發(fā)不易梳落、打結(jié)。本次實驗結(jié)果提示，防脫育發(fā)精華液能提升HGF 表達水平，在實驗過程中兩種方法檢測HGF 蛋白表達，均顯示對照組HGF 蛋白表達最高。 HGF 是一種多功能生長因子[16]，它在肝細(xì)胞中發(fā)揮作用并刺激再生[17-18]的同時，對肝外組織和細(xì)胞的有絲分裂或營養(yǎng)也有促進作用。 本次實驗過程中相較于空白組無干涉措施，對照組伴隨皮下注射這種微小的創(chuàng)傷性刺激，能使局部區(qū)域血管內(nèi)皮生長因子分泌增多，進而刺激上皮細(xì)胞[19]、黑素細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生長和功能發(fā)揮。中醫(yī)外治法中常用梅花針叩刺[20]局部皮膚治療脫發(fā)，發(fā)揮調(diào)和營衛(wèi)氣血、通經(jīng)活絡(luò)的作用，殊途同歸。

本次實驗中局部皮膚組織的DHT 降低明顯，由此推測防脫育發(fā)精華液可通過改善局部毛囊雄激素受體水平，改善毛發(fā)脫落等現(xiàn)象，但雄激素性脫發(fā)病因病機復(fù)雜，亦可進一步研究本品是否具有抑制局部皮膚5α-還原酶作用。

綜上所述，本研究提示防脫育發(fā)精華液對促進雄激素性脫毛大鼠毛發(fā)生長，其機制可能是改善局部毛囊雄激素受體水平，降低DHT 含量，促進HGF表達，其他方面的作用機制還有待進一步研究。