滋腎活血方對血管性癡呆大鼠分裂與融合蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1 的影響

秦 茂，伍大華*，張秀麗，謝 樂

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院腦病科，湖南 長沙 410006

血管性癡呆（vascular dementia, VD）是由腦血管疾病危險因素(例如高血壓、糖尿病、高脂血癥等)或非明顯性腦血管疾病(例如腦白質變性、慢性腦缺血)引起的進行性神經認知綜合征。近幾年來，VD 的發病率呈逐步上升趨勢，給患者及其家庭以及社會帶來極大的負擔[1]。 VD 病因復雜，臨床表現多樣，現代研究表明其發病與腦組織受損相關[2-3]。 在治療上，西醫尚無明確特效藥物。 有研究表明，線粒體功能損傷、能量代謝失常是VD 的重要機制之一[4-5]。滋腎活血方是湖南中醫藥大學附屬中西醫結合醫院國醫大師劉祖貽基于中醫癡呆病“腎精陰虛，瘀阻腦絡”的基本病機所創，具有滋腎填精、活血通絡的功效，臨床療效顯著[6]。有研究證實，滋腎活血方能改善VD 患者的認知功能和中醫證候[7-8]。 課題組研究發現，滋腎活血方可提高VD 大鼠學習和記憶能力，其機制可能與調節VD 大鼠腦組織蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、磷酸化蛋白激酶B（phosphorprotein Kinase B, p-Akt）、酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor, TrkB)、腦源性神經營養因子(brainderived neurotrophic factor, BDNF)蛋白的表達有關[9]。本文研究滋腎活血方對VD 大鼠蛋白表達的影響，探討滋腎活血方治療VD 的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD 大鼠60 只，雄性，鼠齡6～8 周，體質量220～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗場所：湖南中醫藥大學實驗動物中心，使用許可證編號：SYXK（湘）2019-0009。 動物實驗室要求光照充足、通風和空調設備良好。飼養室溫為20～25 ℃、相對濕度為50%～70%。實驗室按常規定期清潔、消毒。 自由攝取食物和飲水。

1.2 藥品及主要試劑、儀器

滋腎活血方由制何首烏15 g、枸杞子30 g、桑椹30 g、五味子5 g、丹參30 g、葛根30 g、益智仁10 g、石菖蒲10 g、郁金10 g、遠志10 g、全蝎3 g、山楂15 g 組成，均為顆粒劑，購自四川新綠色藥業科技發展有限公司，批號分別為21020068、21080009、20080008、21070116、21050010、20030112、20060161、20120087、21030024、21060005、20100102、21080088。使用時取相應藥物溶于蒸餾水配成中藥混懸液，水浴加熱至其完全溶解，4 ℃保存備用，灌胃前于37 ℃水浴加熱。 鹽酸多奈哌齊片（憶知）生產自浙江華海藥業股份有限公司，批號：1426A18002，國藥準字：H20183418。

線粒體融合蛋白1（mitofusin 1, Mfn1）抗體（批號：00070973，武漢三鷹生物技術有限公司）；線粒體融合蛋白2（mitofusin 2, Mfn2）（批號：AC02195823）、線粒體動力蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1,Drp1）（批號：AB02902356）、線粒體分裂蛋白1（fission mitochondrial 1, Fis1）（批號：AG07194254）抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司；4%多聚甲醛（批號：21295584，廣州賽國生物科技有限公司）；顯色試劑盒、通用二步法試劑盒（批號：2111A0525、2126F0627）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；檸檬酸鈉（批號：1114A0148，北京索萊寶科技有限公司）。

Leica UC7 型切片機（德國Leica 公司）；TH4-200 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；SMART V3.0 型動物行為學軟件追蹤系統（美國Harvard Apparatus 公司）。

1.3 動物造模

采用改良2-VO 法[10]制作VD 大鼠模型。隨機留取10 只大鼠不予結扎造模，剩余50 只進行造模。大鼠術前12 h 禁食、4 h 禁水。 大鼠用水合氯醛腹腔麻醉，固定于板上。 頸正中線切開，鈍性分離左側頸總動脈，而后以外科線雙重結扎，術后于小鼠大腿肌肉豐厚處肌內注射青霉素鈉30 萬U/kg。 在7 d后進行相同操作，結扎右側頸總動脈。 假手術組不予結扎。 模型成功的判斷：第2 次結扎術后1 周進行水迷宮測試[11]，前4 天為訓練，依次從4 個象限將大鼠扔入，若大鼠未在60 s 內站上平臺，將其引導至平臺上站立10 s；第5 天從平臺所在象限的對側將大鼠扔入水池，各組大鼠上水中平臺所需時間即為逃避潛伏期（escape latency, EL），60 s 內未上則記為60 s；對每組的EL 進行記錄，以假手術組大鼠EL 的平均值為參考值，計算造模大鼠與假手術組大鼠EL 之差占該鼠EL 的比值，若該值＞20%則為2-VO模型造模成功[12]。

1.4 動物分組及給藥

未結扎大鼠10 只標記為假手術組。 將造模成功大鼠按隨機數字表法分為模型組、滋腎活血高劑量組、滋腎活血中劑量組、滋腎活血低劑量組、西藥組，每組10 只。 每組大鼠按9 mL/(kg·d)劑量灌胃相應藥物。 模型組、假手術組給予蒸餾水，滋腎活血低劑量組、滋腎活血中劑量組、滋腎活血高劑量組分別予以相當于0.5、1、2 倍人常規劑量滋腎活血方溶液[9.8、17.8、35.6 g/(kg·d)]灌胃，西藥組以相當于人常規劑量的多奈哌齊溶液[150 mg/(kg·d)]灌胃，中藥及多奈哌齊劑量均參照徐叔云主編《藥理實驗方法學》[13]換算，采用灌胃法喂藥，每天1 次，連續2 周。

1.5 行為學檢測

末次灌胃的第2 天再次進行水迷宮實驗，方法參考“1.3”，對每組大鼠EL 進行記錄，評估各組大鼠學習記憶功能。

1.6 免疫組化法檢測大鼠海馬組織Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1 蛋白表達

大鼠處死后取海馬組織，4%多聚甲醛固定，切片，二甲苯脫蠟3 次，乙醇洗脫，將切片置于檸檬酸鈉溶液中進行抗原修復，加入過氧化酶阻斷劑以阻斷內源性過氧化氫酶的活性，加入50 μL 用稀釋液稀釋后的一抗，室溫孵育1 h，加入50 μL 二抗（生物素標記的羊抗鼠/兔IgG），室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。倒置顯微鏡下觀察，棕黃色結構為陽性表達，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測陽性結構的面積和強度（光密度），采用平均光密度值來表示陽性表達的水平。

1.7 統計學方法

采用SPSS 28.0 統計軟件處理數據。 計量資料采用“±s”表示，組間比較運用ONE-ANOVA 分析。P＜0.05 為差異具有統計學意義，P＜0.01 為差異具有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 滋腎活血方對大鼠學習記憶功能的影響

與假手術組比較，模型組大鼠EL 明顯延長（P＜0.05），說明造模成功。與模型組對比，滋腎活血低劑量組、滋腎活血中劑量組、滋腎活血高劑量組、西藥組的大鼠EL 明顯縮短（P＜0.05）。與滋腎活血低劑量組比較，滋腎活血中劑量組、滋腎活血高劑量組EL均縮短（P＜0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠EL 比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠EL 比較（±s，n=10）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與滋腎活血低劑量組比較，△P＜0.05。

EL/s 11.000±7.211 34.000±14.107*22.670±13.317#12.330±4.933#△12.330±11.676#△12.500±6.028#組別假手術組模型組滋腎活血低劑量組滋腎活血中劑量組滋腎活血高劑量組西藥組

2.2 滋腎活血方對大鼠海馬組織線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1、Fisl 表達的影響

與假手術組比較，模型組Mfn1、Mfn2、Drp1 蛋白表達量均降低（P＜0.01）；與模型組比較，滋腎活血低劑量組、滋腎活血中劑量組、滋腎活血高劑量組、西藥組Mfn2、Drp1 蛋白表達量均升高（P＜0.01），滋腎活血中劑量組、滋腎活血高劑量組Mfn1 蛋白表達量均升高（P＜0.01），滋腎活血低劑量組Mfn1 蛋白表達量降低（P＜0.01）。與滋腎活血低劑量組比較，滋腎活血中劑量組、滋腎活血高劑量組Mfn1、Drp1 蛋白表達量均升高（P＜0.05）。各組Fisl 蛋白表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表2、圖1～4。

表2 各組大鼠海馬組織Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1 蛋白表達的平均光密度值（n=10，±s）

表2 各組大鼠海馬組織Mfn1、Mfn2、Drp1、Fis1 蛋白表達的平均光密度值（n=10，±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與滋腎活血低劑量組比較，△P＜0.05。

組別假手術組模型組滋腎活血低劑量組滋腎活血中劑量組滋腎活血高劑量組西藥組F 值P 值Mfn1 0.318±0.006 0.297±0.018**0.282±0.013##0.330±0.040##△0.364±0.066##△0.297±0.003 12.021＜0.01 Mfn2 0.318±0.032 0.315±0.015**0.345±0.053##0.346±0.017##0.354±0.051##0.363±0.018##5.039＜0.01 Drp1 0.313±0.015 0.273±0.018**0.294±0.018##0.342±0.012##△0.342±0.057##△0.293±0.001##16.991＜0.01 Fis1 0.309±0.024 0.307±0.044 0.311±0.019 0.318±0.022 0.316±0.030 0.320±0.039 0.500 0.775

圖1 各組大鼠海馬組織Mfn1 蛋白表達比較

圖2 各組大鼠海馬組織Mfn2 蛋白表達比較

3 討論

VD 在中醫學中屬于“呆病”“癡呆”“善忘”等范疇，其病位在腦，涉及心、脾、肝、腎多臟，病性虛實夾雜，多因臟腑功能逐漸衰退，腎精虧損，髓海失養，氣血不足，痰濁內生，瘀血阻竅所致。 相關文獻指出其證型多集中在腎虛、痰濁、瘀血、氣血等方面[14]。西醫目前尚未有明確特效藥針對治療，其主要思路是對癥治療，延緩病情惡化進程，并對認知能力繼發癥狀進行治療，臨床上乙酰膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA）受體拮抗劑、抗炎藥物、腦代謝激動劑、雌激素、抗氧自由基腦保護劑等均對VD 有良好的療效[15-20]。滋腎活血方為國醫大師劉祖貽指導下所創，以活血通竅、滋陰補腎、益智健腦為治法，臨床用于治療VD取得了良好療效， 能有效改善VD 患者的認知功能和中醫證候[7-8]。

圖3 各組大鼠海馬組織Drp1 蛋白表達比較

圖4 各組大鼠海馬組織Fis1 蛋白表達比較

課題組前期研究發現，滋腎活血方能顯著提高VD 大鼠海馬組織自噬相關蛋白表達，促進細胞自噬，保護VD 大鼠神經元，改善其學習記憶能力[21]。VD 是唯一可防治的癡呆疾病[22]，中醫在防治VD 方面取得了良好進展[23]。 近年來，有研究提出，線粒體融合與分裂的異常可能是許多中樞神經系統疾病的發病機制之一[24]。故而，本文通過研究滋腎活血方對大鼠海馬細胞內線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2，線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1 表達的影響，進一步探究滋腎活血湯治療VD 的作用機制，從而為臨床提供新思路，以期為今后中醫發展提供新方向，使中醫藥在防治腦病方面更進一步。

本研究結果顯示，滋腎活血方與多奈哌齊均有調節線粒體融合蛋白Mfn2、線粒體分裂蛋白Drp1表達的作用，經滋腎活血方干預后，Mfn1 蛋白表達量升高，而多奈哌齊干預后Mfn1 蛋白表達量改變不明顯，課題組討論后認為多奈哌齊可能不影響Mfn1 蛋白的表達。 滋腎活血方組內對比發現，滋腎活血中劑量組、滋腎活血高劑量組Drp1、Mfn1 蛋白表達量明顯高于滋腎活血低劑量組，課題組討論后認為結果差異考慮與劑量有關。 通過實驗發現，多奈哌齊、滋腎活血方均可能對線粒體融合、分裂具有調節作用。 有文獻指出，人體細胞中Drp1 蛋白的活性可能不受Fis1 蛋白沉默或過表達的影響[25]，故Fisl蛋白在海馬組織中是否具有維持線粒體功能穩定的作用，值得進一步實驗探討。 通過本研究，課題組認為滋腎活血方在臨床上改善認知功能的機制可能與調節細胞內線粒體分裂與融合有關。