心康沖劑對慢性心力衰竭大鼠去甲腎上腺素轉運蛋白及交感神經系統(tǒng)的影響

唐思琴，郭 冰，劉麗芝，堯忠柳，李 亮，毛以林*

1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

慢性心力衰竭（chronic heart failure, CHF）是指心肌受損后造成心臟結構和功能異常的一組臨床綜合征，是多種心血管疾病的終末階段。隨著我國人口老齡化的加劇，CHF 已成為一種常見的心臟疾病，其發(fā)病率具有逐年增高的趨勢[1]。 血流動力學障礙和神經內分泌系統(tǒng)的異常激活是心力衰竭的主要病理生理機制，其神經內分泌系統(tǒng)主要是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經系統(tǒng)的異常激活，神經內分泌細胞因子系統(tǒng)過度激活作用而引發(fā)的心室重塑是導致CHF 發(fā)生的主要病理生理基礎[2]。 心康沖劑是湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院治療CHF的經驗方，該方由真武湯、升陷湯、參苓白術散三方化裁而來，常用于治療心腎陽虛、脾失健運、水飲內停證型的CHF 患者，臨床療效較好[3-4]。 前期研究發(fā)現(xiàn)，本方能夠改善CHF 患者心功能，抑制心室重塑，改善心力衰竭癥狀，其機制可能與改善心肌能量代謝有關[4]。 為進一步探索心康沖劑治療CHF 的潛在機制，本研究旨在觀察心康沖劑對CHF 大鼠心肌去甲腎上腺素轉運蛋白（norepinephrine transporter,NET）及交感神經興奮性影響，為臨床應用心康沖劑治療CHF 提供可靠實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

60 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質量（150±10） g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。 湖南中醫(yī)藥大學SPF 級動物房飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，相對濕度50%±10%，光照12 h，自由攝食飲水，標準飼料喂養(yǎng)。動物合格證編號：SCXK（湘）2019-0004。 本實驗通過湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核批準（審批號：LLBH-202105180002）。

1.2 藥物

心康沖劑：黃芪30 g，人參10 g，升麻5 g，柴胡5 g，桔梗5 g，茯苓15 g，陳皮10 g，炒白術10 g，薏苡仁30 g，砂仁6 g，制附片10 g，桂枝10 g，姜皮10 g，大腹皮10 g。 由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科提供。注射用鹽酸多柔比星（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，10 mg/瓶，批號：2103E3）；酒石酸美托洛爾片（阿斯利康藥業(yè)有限公司，25 mg/片，批號：2012A73）。

1.3 主要試劑

NET 抗體（批號：10007095）、GAPDH 抗體（批號：00097762）均購自美國Proteintech 公司；DNA 標記（批號：AJG1332A，日本Takara 公司）；UltraSYBR混合物（批號：03821）、mRNA 逆轉錄試劑盒（批號：26621）、蛋白磷酸酶抑制劑（批號：01385）均購自北京康為世紀生物科技有限公司；Trizol（批號：343912，美國Thermo 公司）；Tris（批號：WXBD4821V，美國Sigma 公司）；蛋白酶抑制劑（批號：9087-70-1，北京金泰宏達生物科技有限公司）；ELISA 試劑盒（批號：202103，美國R&D 公司）。

1.4 主要儀器

離心機（型號：H1650R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；酶標分析儀（型號：MB-530，深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；熒光定量RCP 儀（型號：PIKOREAL96）、熒光PCR 板（型號：SPL0960）均購自美國Thermo 公司；電泳儀（型號：DYY-6C）、電泳槽（型號：DYCZ-24DN）、轉膜儀（型號：DYCZ-40D）均購自北京六一生物科技有限公司；便攜式彩色多普勒超聲儀（型號：DW-PF522，徐州大為自動化設備有限公司）；生理記錄儀（型號：BL-420F，成都泰盟科技有限公司）；包埋機（型號：BMJ-A，常州中威電子儀器公司）；顯微鏡（型號：BA210T，廈門麥克奧迪電氣股份有限公司）。

2 方法

2.1 分組及造模

動物適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機取10 只SD 大鼠為正常組，余下50 只大鼠行腹腔注射鹽酸多柔比星進行造模。 參照文獻[5-7]，將注射用鹽酸多柔比星用生理鹽水稀釋成濃度為2 mg/mL，按1 mL/kg 進行腹腔注射，前5 周注射2 次，后5 周每周注射1次，連續(xù)10 周，使建模大鼠鹽酸多柔比星藥量累積至20 mg/kg。 末次注射停藥后1 周，行心臟超聲檢測觀察心臟結構改變，以左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）＜30%，且大鼠出現(xiàn)精神萎靡、體質量增長緩慢、腹水等表現(xiàn)即為造模成功[8]。11 只大鼠在造模過程中死亡。 造模成功后，采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為模型組、心康沖劑組、美托洛爾組，每組13 只。

2.2 干預方法

造模成功后，心康沖劑組及美托洛爾組開始藥物干預治療。 大鼠給藥劑量按動物與人體表面積折算[9]。 心康沖劑組根據(jù)前期研究[10-11]選取最佳有效劑量1.08 g/kg；美托洛爾組予以美托洛爾2.25 mg/kg；空白組、模型組予以生理鹽水15 mL/kg，各組均每天灌胃1 次，連續(xù)給藥6 周后進行相關指標檢測。 模型組、心康沖劑組、美托洛爾組大鼠因鹽酸多柔比星毒性蓄積分別死亡7、5、5 只。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 心臟超聲檢查 采用2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后大鼠取仰臥位，予以前胸備皮涂搽耦合劑，分別獲取胸骨旁左心室長軸和乳頭肌水平短軸切面，選用便攜式彩色多普勒超聲儀，M型超聲，連續(xù)記錄10 個周期后，記錄LVFS、左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction, LVEF）、左室舒張期內徑（left ventricular end diastolic internal dimension, LVIDd）、左室收縮末期內徑（left ventricular end systolic internal dimension, LVIDs）數(shù)值變化，所有數(shù)據(jù)測量3 次，取平均值[12]，均由同一位專業(yè)人員檢測，且該檢測人員不知曉動物分組情況。

2.3.2 血清學檢測指標 大鼠腹主動脈采血后置于抗凝管中，常溫下放置15 min后于離心機中3000 r/min、半徑8 cm、離心15 min，取上清液，于-20 ℃冰箱內保存?zhèn)溆?，嚴格按照試劑盒說明書進行ELISA 法測定大鼠血清腦鈉肽（brain natriuretic peptide, BNP）、去甲腎上腺素（norepinephrine, NE）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α, TNF-α），通過酶標儀讀取數(shù)據(jù)。

2.3.3 心肌病理檢測 經腹主動脈采血后，將大鼠開胸剝離心臟，在生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，于心室最大橫徑處切開，留取最大橫徑至心尖部分約200 mg 置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，進行HE 染色，觀察最大橫徑處心肌組織病理變化。

2.3.4 RT-PCR 法檢測心肌組織NET、TNF-α mRNA 表達 取心尖部組織20 mg，Trizol 提取組織總RNA，然后以組織總mRNA 為模板，逆轉錄為互補DNA，反應體系以GAPDH 為內參基因，在NCBI 上搜索NET 基因序列，primer 5 軟件設計引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。 PCR反應體系為30 μL，包括正反向引物各1 μL，Template 2 μL，ddH2O 11 μL，2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。 擴增條件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，共循環(huán)40 次。 采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達水平的比值。

表1 引物序列

2.3.5 Western blot 檢測心肌組織NET 表達 取各組大鼠心尖部組織25 mg 置于組織裂解液中，按照NET 蛋白定量試劑盒使用說明操作，分離提取蛋白，測定蛋白濃度，隨后進行電泳2.5 h、轉膜140 min、封閉、一抗孵育，用1×PBST 緩沖液將一抗按照一定比例稀釋，NET（大鼠，1∶2000）、GAPDH（兔，1∶3000），將膜與一抗一起孵育，室溫放置90 min。 孵育結束后，用1×PBST 緩沖液洗3 次，每次15 min。 然后二抗孵育用1×PBST 緩沖液稀釋HRP 標記的二抗，稀釋比例（大鼠，1∶5000；兔，1∶6000），將稀釋后的二抗與膜共同孵育90 min。 孵育結束后用1×PBST 緩沖液洗3 次，每次10 min。隨后用ECL 顯色曝光、顯影沖洗。

2.3.6 生物信號采集系統(tǒng)檢測頸交感神經放電（sympathetic nervous system activity, SNA） 將大鼠麻醉后，取仰臥位，沿頸部正中線剪開皮膚，逐層分離皮膚、肌肉、筋膜，暴露氣管、頸總動脈及神經，用玻璃分針分出交感神經心支，并將其掛于雙極鉑銀絲電極，表面滴加37 ℃石蠟油以保持濕潤，接生物信號采集系統(tǒng)，記錄基礎放電情況。 為誘導SNA 的最高峰,后靜脈注射硝普鈉（100 ug/kg）[13]。 最終將基礎放電和最高放電值之比作為統(tǒng)計學數(shù)據(jù)[14]。

2.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。 計量資料以“±s”表示，若滿足正態(tài)分布、方差齊性，組間兩兩比較采用最小顯著法（LSD）檢驗；若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)秩和檢驗。 以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠行為學情況

模型組大鼠精神萎靡、鼠毛疏松易脫、大量腹水，部分出現(xiàn)體質量減輕、活躍度降低、進食少，個別大鼠出現(xiàn)便溏。美托洛爾組反應稍遲鈍，有腹水，體質量增長緩慢。心康組大鼠喜靜臥，鼠毛缺乏光澤，有腹水，體質量緩慢增加，活躍度降低。 空白組大鼠鼠毛光澤，反應靈敏，正常進食進水，二便正常，腹部平坦，體質量逐漸增加。

3.2 各組大鼠心臟超聲結果

與空白組比較，模型組LVIDs、LVIDd 均明顯升高（P＜0.01），LVFS、LVEF 均明顯降低（P＜0.01）。 與模型組比較，心康沖劑組和美托洛爾組LVEF、LVFS均明顯升高（P＜0.05），LVIDd、LVIDs 均明顯降低（P＜0.05）。 心康沖劑組與美托洛爾組間LVEF、LVFS、LVIDd、LVIDs 比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠心功能指標比較（±s）

表2 各組大鼠心功能指標比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別空白組模型組心康沖劑組美托洛爾組n 6 6 8 8 LVEF/%87.8±4.7 49.7±7.6**68.8±14.1▲67.8±6.8▲LVFS/%61.2±10.5 24±3.9**37.9±3.3▲35.6±5.2▲LVIDd/mm 5.8±0.5 6.6±0.6**5.8±0.5▲5.9±0.5▲LVIDs/mm 1.8±0.4 5.2±0.6**3.8±0.7▲4.0±0.8▲

3.3 各組大鼠血清BNP、NE、TNF-α 水平

與空白組比較，模型組BNP、NE、TNF-α 均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，美托洛爾組與心康沖劑組BNP、NE、TNF-α 均明顯降低（P＜0.01）。相比，心康沖劑組與美托洛爾組間BNP、NE、TNF-α 比較，差異均無統(tǒng)計學意義。 詳見表3。

表3 各組大鼠血清BNP、NE、TNF-α 水平比較（±s，n=6）

表3 各組大鼠血清BNP、NE、TNF-α 水平比較（±s，n=6）

注：與空白組比，**P＜0.01；與模型組比，▲▲P＜0.01。

組別空白組模型組心康沖劑組美托洛爾組n 66 88 BNP 125.32±4.93 152.05±6.94*138.32±4.10▲▲142.64±4.42▲▲NE 138.78±6.68 175.92±10.69*159.02±6.94▲▲164.19±4.17▲▲TNF-α 259.22±17.57 323.93±12.78*289.88±9.06▲▲295.28±10.34▲▲

3.4 大鼠心肌組織病理學結果

空白組心肌細胞結構均勻，邊緣清晰，排列整齊。 與空白組相比，模型組心肌細胞可見肥大水腫，結構模糊，排列不規(guī)則，有少量炎性細胞浸潤。 與模型組相比，心康沖劑組和美托洛爾組心肌細胞水腫及炎性細胞浸潤程度有不同程度減輕。 詳見圖1。

圖1 各組心肌組織HE 染色圖（×400）

3.5 各組大鼠心肌組織NET、TNF-α mRNA 表達情況

與空白組比較，模型組NET mRNA 表達明顯降低（P＜0.01），TNF-α mRNA 明顯升高（P＜0.01）。 與模型組比較，心康沖劑組和美托洛爾組NET mRNA表達均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），TNF-α mRNA表達明顯降低（P＜0.01）。與美托洛爾組比較，心康沖劑組NET mRNA 表達明顯升高（P＜0.01），TNF-α mRNA表達明顯降低（P＜0.01）。 詳見表4。

表4 各組大鼠心肌NET、TNF-α mRNA 表達比較（±s，n=4）

表4 各組大鼠心肌NET、TNF-α mRNA 表達比較（±s，n=4）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與美托洛爾組比較，##P＜0.01。

組別空白組模型組心康沖劑組美托洛爾組NET 1.08±0.14 0.25±0.03**0.59±0.08▲▲##0.40±0.02▲TNF-α 1.04±0.06 7.78±1.29**1.63±0.32▲▲##3.51±0.57▲▲

3.6 各組大鼠心肌組織NET 表達情況

與空白組比較，模型組NET 相對表達量明顯降低（P＜0.01）。 與模型組比較，心康沖劑組和美托洛爾組NET 相對表達量均明顯升高（P＜0.01）。 心康沖劑組與美托洛爾組間NET 相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 詳見表5、圖2。

表5 各組大鼠心肌NET 相對表達量比較（±s，n=4）

表5 各組大鼠心肌NET 相對表達量比較（±s，n=4）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組別空白組模型組心康沖劑組美托洛爾組NET 0.71±0.10 0.10±0.02**0.44±0.09▲▲0.34±0.14▲▲

圖2 各組大鼠心肌組織中NET 表達電泳圖

3.7 各組大鼠頸SNA 情況

與空白組比較，模型組SNA 明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，心康沖劑組和美托洛爾組SNA 明顯降低（P＜0.01）。 心康沖劑組與美托洛爾組間SNA 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 詳見表6。

表6 各組大鼠SNA 比較（±s，n=4）

表6 各組大鼠SNA 比較（±s，n=4）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組別空白組模型組心康沖劑組美托洛爾組SNA 46.29±14.49 166.57±26.18**102.56±16.71▲▲87.54±9.31▲▲

4 討論

CHF 屬于中醫(yī)學“水腫”“喘證”范疇。CHF 患者初期多以心肺氣虛為主，繼而出現(xiàn)心陽不足，累及脾腎。 脾腎陽虛則水飲內停，主要表現(xiàn)為胸悶氣短、呼吸困難、畏寒、納差、乏力、雙下肢水腫等，故治療應以升補宗氣、溫陽利水為主。 心康沖劑治以溫陽補氣，健脾利水，方中黃芪、人參、升麻、柴胡、桔梗以升陷湯之意大補宗氣，茯苓、陳皮、炒白術、薏苡仁、砂仁以健脾利水，佐入制附片、桂枝以增強溫陽化飲之力，配伍姜皮、大腹皮借“以皮行皮”之意以利水消腫。 前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，心康沖劑可改善CHF 患者證候學指標，改善心功能，提高患者生活質量[3]。

NET 為交感神經遞質傳導過程中的重要一環(huán)，尤其是在心血管系統(tǒng)方面[15-16]。 生理情況下，交感神經突觸前膜上的NET 可將交感神經沖動所發(fā)出的NE 通過再攝取方式回到神經末梢中[17]。心臟是交感神經豐富器官，心臟交感神經NET mRNA 在心臟交感神經節(jié)中表達[18]。 目前，可采用同位素標記NET特異性配體法檢測離體心肌組織中結合點變化，或采用核素顯像技術進行心肌交感神經NE 再攝取功能檢測[19]。心衰早期NET 表達下調，故NE 再攝取障礙，導致交感神經興奮性增加。 NE 在血中濃度變化取決于交感神經釋放的速度，隨著交感神經系統(tǒng)活性增強而上升，反之則下降。 NE 是交感神經纖維末端釋放的神經遞質，是一種潛在的促炎介質，可誘導釋放多種炎癥因子。 TNF-α 是炎癥級聯(lián)反應的重要成員，交感神經持續(xù)興奮可導致大量細胞因子釋放，激活免疫系統(tǒng)，出現(xiàn)代償性抗炎反應。 CHF 狀態(tài)下交感神經系統(tǒng)和免疫炎性系統(tǒng)激活之間有相互作用，故抑制CHF 時的交感系統(tǒng)興奮性可降低中樞促炎性因子的釋放。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，心康沖劑通過降低血漿腎素活性、血管緊張素Ⅱ、醛固酮水平，抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性，調節(jié)CHF 內分泌系統(tǒng)變化，保護心肌細胞[20]。為進一步探索心衰發(fā)生發(fā)展的病理機制，本研究從交感神經系統(tǒng)方面進行研究。在CHF 早期交感神經系統(tǒng)的激活可維持一定的心輸出量和組織器官的血流灌注，是機體的一種代償機制。 隨著病情進展，出現(xiàn)血流動力學和神經-體液因素的紊亂，如醛固酮、血管緊張素Ⅱ等體液因子增多，導致水鈉潴留、心肌重構。 故長時間交感神經系統(tǒng)的高度激活是心室重塑和病情惡化的危險因素。因此，阻斷神經內分泌系統(tǒng)的過度激活是防治心室重構治療CHF 的關鍵[21]。 β 受體阻滯劑可有效抑制交感神經系統(tǒng)活性、減慢心率、抑制心肌收縮從而保護心肌。 美托洛爾屬于臨床常用β 受體阻滯劑，在心力衰竭、冠心病、高血壓等心血管疾病治療過程中需長期服用[22-23]。 研究表明，美托洛爾可改善冠心病心力衰竭患者臨床癥狀、促進心功能恢復、減少并發(fā)癥，可顯著提高臨床療效[24]。 潘宇等[25]研究證明美托洛爾通過抑制β-AR-AC-cAMP 信號轉導通路，降低應激狀態(tài)下家兔交感興奮性，減少NE 釋放，提高心室穩(wěn)定性。徐振興等[26]研究表明美托洛爾治療急性心肌梗死大鼠可以改善心肌神經生長因子表達和交感神經再生。為明確抑制交感神經興奮是否可以減少心肌耗氧量，拮抗心室重塑，從而治療CHF。因此，本研究選擇美托洛爾作為陽性對照藥物。

本實驗研究表明，與空白組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS 均顯著降低，血清BNP、NE、TNF-α 水平均明顯升高；心肌組織中NET mRNA 及NET 蛋白的表達明顯降低，興奮性明顯增高。TNF-α mRNA表達明顯增加。經心康沖劑干預后大鼠LVEF、LVFS不同程度增加，血清BNP、NE、TNF-α 值不同程度下降；心肌組織中NET mRNA 及NET 蛋白的表達顯著增加，交感神經興奮性降低。 TNF-α mRNA 表達明顯下降。以上結果說明心康沖劑可通過增加交感神經遞質的表達，上調NET 蛋白，從而降低交感神經興奮作用以發(fā)揮改善大鼠心功能、抑制炎癥因子釋放、抑制心室重構功效，其效力與美托洛爾相當。 本研究只是對心臟、交感神經的初步探索，其防治CHF的作用機制有待進一步深入研究。