針灸對克羅恩病模型大鼠天樞穴局部皮膚中緩激肽、CGRP 和NPY 的影響

周競穎，來奕恬，丁攀婷，張國山*，劉 密*

1.湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學針灸推拿與康復學院，湖南 長沙 410208

克羅恩病（Crohn's disease, CD）是一種慢性炎癥性疾病，可能發生于口腔到肛門中的任意一段消化道。 近年來，我國發病人群不斷增多，首發癥狀包括腹痛、慢性腹瀉、瘺管形成和肛周病變等，且通常伴有腸外癥狀，嚴重影響患者的生活質量[1-2]。 由于先天性免疫和獲得性免疫失調，CD 易反復發作，需要長期的藥物維持治療，目前仍無特異性療法。針灸作為中醫傳統療法，具有溫通經絡、行氣活血、補虛抗邪等功效，在腸道疾病臨床治療中使用廣泛，取得了良好的治療效果[3]。 根據CD 的臨床癥狀特點，中醫辨證其病位在腸，而天樞穴是大腸的募穴，作為腸腑病癥的常用穴位[4]。 皮膚作為感受針灸刺激的首個環節，可能是其發揮療效的首要部位，穴位存在于體表，而體表皮膚中密集分布著神經纖維，它們可以釋放不同類型的神經肽，與全身的免疫細胞群進行交流[5]。 故研究針刺與艾灸啟動初始階段的效應，可通過觀察局部穴區組織神經肽的變化來加以分析。因此，本研究通過觀察天樞穴局部皮膚中緩激肽（bradykinin, BK）、降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptid, CGRP）、神經肽Y（neuropeptide Y,NPY）的蛋白表達水平變化，探討針灸治療CD 在初始啟動環節對腧穴局部皮膚的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級SD 雄性大鼠50 只，體質量為150～180 g，由廈門大學實驗研究動物管理中心提供，實驗動物許可號：SYXK(閩)1216-0006。 飼養于廈門大學實驗動物中心，飼養室溫度控制在18～26 ℃，濕度控制在40%～70%，晝夜交替周期為12 h。 大鼠自由進食進水，適應性飼養7 d 后，完全隨機分成正常組、模型組、針刺組、艾灸組和西藥組，每組10 只。 實驗研究過程中進行的操作和處理方式符合《關于善待實驗動物的指導性意見》規定。

1.2 主要試劑及儀器

2，4，6-三硝基苯磺酸溶液（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS）（上海Sigma Alrdich 公司，批號：762229）；Western blot 試劑盒（武漢默沙克公司，批號：BA23387）；ELISA 試劑盒（武漢貝萊茵生物科技公司，批號：RA21360）；BA110S 萬分之一電子天平（德國Sartorius 公司，型號：BCE224-1CCN）；病理組織包埋機(武漢俊杰電子有限公司，型號：JBP5)；石蠟病理切片機(上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016)；SPECTRAMAX 多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司，型號：SpectraMax M3）；艾條（湖香艾生物科技有限公司，0.7 cm×2 cm）；針灸針（蘇州醫療用品有限公司，0.25 mm×25 mm）。

1.3 模型制備及評價標準

應用TNBS 制備CD 腸纖維化大鼠模型：將5%（W/V）TNBS 與50%乙醇按2∶1 比例混合成TNBS灌腸液[2]。用改良型灌胃針連接注射器，按3 mL/kg 大鼠體質量抽取適量灌腸液，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后將其頭下尾上倒置，然后把灌胃針緩慢插入肛門6～8 cm，注入灌腸液，當注射器內灌腸液消失后繼續推進0.2 mL 空氣，以保證灌腸液完全注入腸腔。 然后拔出灌胃針，再將大鼠倒立1 min 左右，以防液體溢出。 每隔7 d 重復灌腸1 次，共4 次。 模型制備成功的評價標準[2]：大鼠出現不同程度的少食、稀便、黏液便，體質量減輕；部分大鼠出現血便，經隱血試劑測試顯陽性；結腸出現典型的鵝卵石樣改變，黏膜充血、出血、糜爛，偶見線性潰瘍；病理切片見中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。

1.4 干預方法

參照李忠仁主編的《實驗針灸學》及擬人比照法[6]，選取雙側天樞穴和上巨虛穴進行針刺與艾灸干預。大鼠天樞穴位于胸劍聯合下40 mm，腹直肌及其鞘處，相距前正中線5 mm；上巨虛穴位于大鼠膝關節外下方腓骨小頭下約10 mm 處，足三里向下約5 mm處。

模型制備成功后，將針刺組大鼠固定，使其腹部與四肢暴露，用75%的乙醇消毒大鼠雙側天樞穴和上巨虛穴后，將針灸針刺入3～5 mm，行捻轉手法20 s后留針15 min，治療中間及拔針時各行捻轉手法20 s；采用相同的方法將艾灸組大鼠固定并腧穴局部消毒后，將溫灸純艾條（0.7 cm×12 cm）置于雙側天樞穴和上巨虛穴上方3～5 cm 處，每次15 min（首次施灸時采用自制體表溫度傳感器，將其固定于施灸部位，以確保艾灸時皮膚感受溫度波動在45 ℃左右）；用雙蒸水與研磨后的美沙拉嗪腸溶片混合配制成灌胃液，按照成人體質量（70 kg）用藥量為4 g/d，以大鼠體質量（200 g）換算大鼠投藥量為0.36 g/kg，每天給予西藥組大鼠灌胃處理[7]。 3 組干預方法均每天1次，連續干預7 d。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 一般行為學觀察 每天觀察大鼠的日常情況，包括精神狀況、皮毛顏色光澤、反應靈敏程度、活動度、攝食量、攝水量、肛周情況、大小便性狀及存活數量等。

1.5.2 結腸病理形態學觀察 干預結束后，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，然后將其固定于鼠板上，打開腹腔，截取距肛門6～7 cm 處結腸約1 cm，縱向剖開后用冰生理鹽水沖洗干凈，肉眼觀察其病理形態學變化；然后剪取肉眼可見損傷最明顯的腸組織2 cm 左右，將其置于4 %多聚甲醛固定液中固定24 h，行HE 染色后，光學顯微鏡下觀察其病理形態學變化。

1.5.3 天樞穴局部皮膚中BK、CGRP、NPY 的表達

各組大鼠天樞穴局部皮膚除毛后，剪取少許天樞穴局部皮膚組織（約5 mm×5 mm×5 mm），將其置于勻漿器中剪碎，加入裂解液充分裂解勻漿30 min，然后將其轉移至1.5 mL 的離心管中，在4 ℃下12 000 r/min、半徑為10 cm 離心10 min，取0.5 mL 上層清液并將其置于凍存管中，儲存于-20 ℃冰箱待檢測。分別采用ELISA 法檢測BK 的蛋白含量，采用Western blot法檢測CGRP、NPY 的蛋白相對表達。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件系統進行分析。 各項檢驗指標的統計數據，首先進行正態性檢驗。若符合正態分布則用“±s”表示，再進行方差齊性檢驗，若符合則使用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；若不符合方差齊性則用Dunnet T3 分析。 若實驗研究數據不符合正態分布和方差齊性，采用秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

造模前，各組大鼠精神狀態好，毛色光澤而活動靈敏，食量、二便均正常。造模后，正常組較造模前無明顯變化，模型組大鼠精神萎靡、嗜臥，毛發稀疏暗黃，對外界刺激靈敏度下降，厭食消瘦，體質量明顯下降，肛周可見淺黃色糊狀糞便，部分大鼠甚至可見黏液膿血便或血便。干預后，正常組和模型組較干預前無明顯變化，針刺組、艾灸組和西藥組大鼠的精神狀態、毛發光澤度、活動度、二便情況等均有顯著改善。 造模及針灸、藥物干預過程中，均未出現大鼠死亡。

2.2 各組大鼠結腸病理形態學比較

肉眼觀察可見：正常組大鼠結腸組織呈淡紅色，質地光滑柔軟，沒有出現明顯充血、水腫以及增生現象，腸壁較薄；模型組大鼠結腸內壁可見典型的鵝卵石樣改變，局部可見明顯潰瘍及息肉，顏色暗紅，腸壁增厚變硬；經過治療后，針刺組、艾灸組和西藥組大鼠結腸損傷情況較模型組均有明顯改善，結腸組織較模型組柔軟光滑，局部充血和水腫情況較輕，并未見明顯潰瘍糜爛面，腸壁變薄。 HE 染色后，在光鏡下可見：正常組大鼠結腸組織的腺體結構較完整,結腸腸壁肌層、漿膜層的層次清晰，未見增生、充血水腫等現象；模型組大鼠可見腺體結構破壞，黏膜層損傷嚴重，結腸黏膜上皮層有明顯缺損、存在裂隙狀潰瘍，黏膜下層組織水腫嚴重，大量炎癥細胞浸潤，偶有結節病樣肉芽腫；經過治療后，針刺組、艾灸組和西藥組大鼠可見結腸腺體結構恢復，黏膜損傷修復，層次清晰明顯，炎癥細胞浸潤明顯改善，結腸組織水腫減輕。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠結腸組織鏡下觀察比較（HE，×100）

2.3 各組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 含量比較

與正常組相比，模型組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 的含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，針刺組、 艾灸組和西藥組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 的含量均顯著降低（P＜0.01）；針刺組、艾灸組和西藥組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 的含量相比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 含量比較（μg/mL，±s）

表1 各組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 含量比較（μg/mL，±s）

注：與正常組相比，▲▲P＜0.01；與模型組相比，★★P＜0.01。

組別正常組模型組針刺組艾灸組西藥組n 10 10 10 10 10 BK 含量8.24±2.11 19.09±3.57▲▲12.78±2.33★★10.12±1.51★★10.35±1.49★★

2.4 各組大鼠天樞穴局部皮膚中CGRP、NPY 蛋白相對表達量比較

與正常組相比，模型組大鼠天樞穴局部皮膚中CGRP 相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組、艾灸組和西藥組大鼠天樞穴局部皮膚中CGRP 相對表達量均顯著升高（P＜0.01 或P＜0.05）。 模型組與正常組大鼠相比，針刺組、艾灸組和西藥組分別與模型組大鼠相比，天樞穴局部皮膚中NPY 相對表達量差異均無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖2、表2。

圖2 各組大鼠天樞穴局部皮膚中NPY、CGRP 蛋白電泳圖

表2 各組大鼠天樞穴局部皮膚中NPY、CGRP 蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組大鼠天樞穴局部皮膚中NPY、CGRP 蛋白相對表達量比較（±s）

注：與正常組相比，▲▲P＜0.05；與模型組相比，★★P＜0.01，★P＜0.05。

組別正常組模型組針刺組艾灸組西藥組n 10 10 10 10 10 CGRP 1.00±0.20 0.21±0.16▲▲1.35±0.20★1.22±0.04★★1.02±0.09★NPY 1.00±0.12 1.37±0.15 1.21±0.02 1.17±0.06 1.03±0.12

3 討論

現代醫學治療CD 以控制炎癥、緩解癥狀為治療目標，多使用糖皮質激素、生物制劑及免疫抑制劑等作為治療手段[8]。 一旦確診，患者需要面對終身服藥的可能，長期使用產生較多不良反應，同時持續的西藥較為昂貴[9]，患者易產生恐懼心理，從而導致治療的依從性降低，對其社會功能產生嚴重影響[10]。艾灸和針刺作為我國中醫傳統治療方法，能夠多靶點、多通路的調節全身免疫系統功能，不僅效優價廉，而且不良反應較少，且隨訪發現針灸對于慢性腸道疾病的療效明顯優于西藥長期治療，在臨床上取得了良好的治療效果[11]。《素問·靈蘭秘典論》中認為：“小腸者，受盛之官，化物出焉。 大腸者，傳道之官，變化出焉。 ”因此，推測腹痛、腹瀉等CD 的主要臨床癥狀，與“大腸傳導”和“小腸泌別清濁”的功能失常有關，其病位在腸。 針灸治療時辨經論治，可選取“起于胃口，下循腹里”的足陽明胃經，其經脈循行穿過腸腑。天樞穴屬足陽明胃經，同時是大腸募穴，符合“經脈所過，主治所及”和“局部取穴”等針灸選穴規律[12]。天樞穴是治療腸腑病癥的要穴，更是運行全身氣機的樞紐，具有調暢全身氣機、調節腸腑功能的作用[13]。因此，本研究選取天樞穴局部皮膚組織，作為針灸治療CD 始動機制的觀察部位。

近年來，隨著皮膚-皮膚神經-神經內分泌軸及免疫系統之間交互作用網絡研究的深入，皮膚與神經、免疫、內分泌系統之間的緊密聯系得到了進一步證實。 皮膚免疫細胞中朗格漢斯細胞、角質形成細胞、肥大細胞等能夠激活和產生多種炎癥細胞因子和趨化因子，引起炎癥反應[14]。 同時，皮膚中肥大細胞與梅克爾細胞均能與感覺神經發生交互作用，使得皮膚在神經調節下發揮穩定的效應機制[15]。 由此可見，皮膚不僅是物理屏障，它還是一個巨大的免疫器官、免疫場所，大量的免疫反應在此進行。 “皮膚-神經-免疫”學說與傳統醫學的“臟腑-經絡”相關理論有相似之處。 在“臟腑-經絡”相關理論中，臟腑的異常改變可以反映到相應的體表穴區，表現出特定的癥狀和體征，同時刺激特定的穴位可對相應臟腑的生理功能和病理改變起到調節作用[16]。研究發現，針灸天樞穴、氣海穴能夠改善CD 大鼠的腸纖維化，下調結腸組織中TGF-β 蛋白、Smad4 蛋白及其mRNA 的表達，抑制腸上皮細胞的異常凋亡，保護腸上皮細胞屏障，減輕腸道炎性反應，從而抑制CD 導致的腸上皮纖維化[17]。可見，通過針灸干預相應的腧穴即可治療臟腑的病變，這給針灸治療CD 的機制研究提供了新的思路和方法。 而針灸等外治療法首先作用于腧穴局部的皮膚，其中，皮膚神經肽是聯系皮膚免疫系統與神經系統的橋梁，皮膚神經末梢分泌神經肽能影響活化的免疫細胞[14]。因此，本研究以皮膚免疫系統為切入點，觀察針灸對CD 模型大鼠天樞穴局部皮膚中相關炎癥因子的調節作用，旨在從皮膚免疫角度揭示針灸治療CD 的可能作用機制。

BK 是激肽釋放酶-激肽系統的重要組成部分，能夠激活外周神經纖維周圍非神經細胞上的受體，間接作用于初級感覺神經末梢，增大傷害性信息的傳入；通常激肽原在機體遭受過度激活和病理刺激時會產生促炎狀態[18]。 BK 通過緩激肽B2 受體影響腸道黏膜下神經叢環氧合酶2 的表達，催化花生四烯酸轉化為前列腺素E2 并刺激其釋放，參與腸道炎癥反應[19]。 研究表明，BK 在炎性痛和神經病理性痛的發生、維持中發揮重要的作用，BK 在疼痛的產生和傳導以及針刺鎮痛過程中起著不可或缺的作用[20]。本實驗模型組在結腸組織發生損傷、炎癥的情況下，天樞穴局部皮膚中BK 的含量明顯升高，表明天樞穴局部皮膚中致痛物質BK 參與神經纖維的激活和傳導，激肽原處于激活狀態，說明在CD 狀態下天樞穴局部皮膚存在炎性疼痛和神經病理性疼痛反應；與模型組相比，艾灸組、針刺組和西藥組3 組大鼠天樞穴局部皮膚中BK 的含量均顯著降低，這可能預示著針灸和西藥都對CD 模型大鼠腸炎癥狀具有緩解作用，與天樞穴局部皮膚中穴區致痛物質和炎癥介質含量的調節有關。

CGRP 存在于皮膚的感覺神經纖維中，主要由背神經節合成，皮膚中淋巴細胞等非神經細胞也可表達，傷害性感覺神經刺激其末梢釋放CGRP 并傳導疼痛，CGRP 能直接作用于巨噬細胞和樹突細胞，參與調節全身炎癥反應，結腸段是CD 的高發部位，且CGRP 已被證實與結腸內臟痛有著密切關系[21-22]；CGRP 可調節T 淋巴細胞增殖和細胞毒作用，促進T 淋巴細胞和巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6、IL-12 和前列腺素等[23]；CGRP 能夠維持腸道黏膜的完整性，這可能是未來干預CD 等腸道疾病的重要手段[24-25]。研究發現，通過針灸使體內CGRP 含量升高，對于結腸具有保護作用[25]。本研究結果顯示，針刺組和艾灸組天樞穴區皮膚中CGRP 蛋白相對表達量也顯著上升，猜測其原因可能為針灸刺激傷害性感覺神經引起神經遞質CGRP 釋放，其后與機體皮膚中淋巴細胞、樹突細胞相互作用，調節相應細胞因子的分泌。由此推測，CGRP 可能參與了針刺和艾灸干預的皮膚免疫過程。

NPY 廣泛分布于人體的中樞和外周神經系統，在皮膚中分布于真皮深層血管周圍[26]。 研究表明，NPY與腸道炎癥反應密切相關，NPY 在炎性腸病大鼠腸內神經元中的表達水平顯著上調[27]。 楊敏等[28]使用針灸治療腸易激綜合征模型大鼠，結果顯示針灸能夠改善其腦-腸軸失衡，下調肥大細胞數量，升高腦組織和腸組織中的NPY 濃度。 還有研究表明，艾灸足三里后，能夠調節局部組織中NPY 的含量，但針刺時含量變化不明顯[29]。本次實驗中，模型組與正常組大鼠之間，針刺組、艾灸組和西藥組3 個治療組與模型組之間對比，差異均無統計學意義（P＞0.05），提示本研究所制備的CD 模型大鼠不足以引起其天樞穴局部皮膚中NPY 產生顯著性變化。

本次實驗通過現代技術手段證明，與正常大鼠相比，CD 模型大鼠天樞穴局部皮膚中CGRP 蛋白的相對表達顯著降低，BK 的含量顯著升高， 提示CD 大鼠天樞穴局部皮膚中BK、CGRP 的變化可能是腸腑病變在體表的客觀反映。 進一步來說，針灸能夠提高CD 模型大鼠穴區局部皮膚中的CGRP 蛋白水平，降低致痛因子BK 的含量，由此推測，針刺、艾灸對CD 模型大鼠癥狀有緩解作用， 可能與其對天樞穴局部皮膚組織神經肽如BK、CGRP 含量的調節有關。