按揉承山穴對CCI 模型大鼠機械足反射閾值及坐骨神經形態學影響研究

王建珠，鮑云帆，楊小存，田志剛，唐燕定，郝 鋒*

1.南京中醫藥大學針灸推拿學院，江蘇 南京 210023；2.南京醫科大學附屬兒童醫院，江蘇 南京 210093

疼痛是臨床中多種疾病共有的癥狀之一。 2020年，國際疼痛研究學會（International Association for the Study of Pain, IASP）將疼痛定義修訂為：“疼痛是一種與實際或潛在的組織損傷相關的不愉快的感覺和情緒情感體驗，或與此相似的經歷。 ”[1-2]神經病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是常見的一種疼痛，由外傷或疾病引起，造成外周神經損傷，患者會表現出自發性疼痛、感覺異常、痛覺過敏等癥狀體征，且疼痛感明顯、持續時間長[3]，是人類最難治療的疾病之一。 神經病理性疼痛作為推拿臨床的常見病種，近年來逐漸成為推拿基礎研究的熱點之一[4-5]，但推拿手法的鎮痛機制仍有待深入研究。 相關研究發現，推拿對坐骨神經慢性壓迫損傷（chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI）模型大鼠的疼痛有良好的鎮痛效應，并改善其后肢步態，延緩腓腸肌的萎縮[6-7]。神經源性肌肉萎縮是常見的肌萎縮原因之一，當運動神經元或者神經纖維損傷時，它們所支配的肌肉就會發生以萎縮為主的改變[8]。 本研究擬觀察推拿按揉法（下文簡稱按揉法）在承山穴操作對CCI 模型大鼠機械足反射閾值（paw withdrawal threshold, PWT）及坐骨神經形態學的影響，為推拿手法的鎮痛作用提供理論依據。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD 大鼠共24 只，體質量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005]。分籠成對飼養，正常飲水，室溫（22±1） ℃，濕度40%～50%，12 h/12 h晝夜節律交替。 飼養地點為復旦大學上海醫學院實驗動物科學中心，清潔級。 動物保護及動物使用規范均按照國際疼痛研究學會的規定嚴格進行。

1.2 主要藥品和儀器

大鼠推拿操作固定裝置（自制）；剃毛器（型號：HP6341/00，美國Philips 公司）；醫用縫合針（型號：4-0 角針1/2，上海漢康醫療器械有限公司）；可吸收外科縫線（型號：4-0，山東博達醫療用品有限公司）；von-Frey 纖毛（型號：NC12775，美國Stolting 公司）；石蠟切片機（型號：RM2415，德國Leica 公司）；切片漂烘溫控儀（型號：QP-B1，安徽電力科學研究所）；電子光鏡（型號：CX-31，日本Olympus 公司）；無線觸覺力測量指套（型號：Grip 系統，美國Finger TPS公司）。

2 方法

2.1 動物分組

將24 只SD 雄性大鼠按照隨機數字表法分為空白組（N 組）、模型組（M 組）和按揉承山穴組（T組），每組8 只。

2.2 CCI 模型制備

參照CCI 大鼠模型制備方法[9]進行造模，于大鼠右后肢進行造模手術。 具體操作步驟[10]：（1）使用戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉，待大鼠深度麻醉后，剔除大鼠右后肢手術部位的鼠毛；（2）深度麻醉成功后將大鼠側臥位，用手術鑷將大鼠舌頭拉出口腔防止窒息，用聚維酮碘及乙醇對手術部位皮膚進行消毒；（3）用手術剪在大鼠右股骨中段后方約1 cm 處，以平行于股骨的方向切開皮膚、暴露肌肉，再用尖頭彎鉗經過股二頭肌間隙對肌肉進行鈍性分離，直至可見坐骨神經[11]，接著用實驗動物手術擴張器在切口處打開手術視野，用玻璃分針將坐骨神經和粘連的軟組織輕柔分離；（4）在坐骨神經分成三支前的神經主干部位游離約7 mm 左右的坐骨神經，在離坐骨神經分叉處上方約2 mm 處起，用生理鹽水浸泡過12 h 的鉻制羊腸線（規格為4-0）結扎坐骨神經，結扎線間隔約1 mm，共扎3 道，結扎時應隨時觀察結扎線的松緊度，保證坐骨神經的血供，結扎的松緊度以打結時大鼠后肢肌肉出現輕微抽動并且線結能在游離出的坐骨神經上輕微滑動為宜；（5）結扎完畢后用生理鹽水進行局部沖洗，逐層縫合手術部位的肌肉及皮膚，并對模型大鼠用硫酸阿米卡星（10 mg/kg）進行預防性腹腔注射，防止發生感染；（6）術后大鼠用紅外燈保暖處理，直至大鼠恢復知覺。 術后模型大鼠成對飼養，自由飲水和進食。

2.3 推拿干預方法

對CCI 模型大鼠右后肢承山穴行拇指按揉法[12]干預，10 min/次，1 次/d，連續干預14 d。 手法操作時，操作者右手拇指戴上由美國Finger TPS 公司生產的無線觸覺力指套，按揉法操作的干預參數設定壓力為5 N，頻率為2 Hz。

2.4 各組動物的處理

N 組不作特殊處理；M 組僅進行CCI 模型造模；T 組行CCI 模型造模術，并于術后第4 天起對模型大鼠右后肢承山穴行拇指按揉法干預，方法見“2.3 推拿干預方法”。

2.5 觀察指標及檢測方法

實驗進行階段，分別于造模前、造模后1 d、3 d、7 d、10 d、14 d、17 d 觀察各組大鼠PWT。待實驗干預結束后，對各組實驗動物取材，將各組大鼠坐骨神經行HE 染色后在電子光鏡下觀察神經纖維的變化。

2.5.1 PWT 測定 采用von-Frey 方法測試各組大鼠的PWT。 用不同粗細的纖毛刺激大鼠足底，能夠引起大鼠縮爪反應的最小纖毛克數即為PWT[10，13]。將大鼠置于孔徑為正方形（規格為10 mm×10 mm）的金屬網格平臺，使用透明有機玻璃框架（規格為20 cm×20 cm×20 cm）將大鼠隔開，框架頂部蓋有預留直徑1 cm 透氣孔的有機玻璃蓋。正式測試前須將大鼠置于測試環境中連續適應3 d。 正式測試時，大鼠需靜置于測試籠中30 min 以適應環境，然后再開始測試[10]。測試方法：用1～26 g 不同等級的von-Frey 纖毛進行測試，由低刻等級逐級向高刻等級進行測試，測試時用von-Frey 纖毛刺激大鼠的右后肢足底心，加壓至纖毛彎曲至90°左右，同等壓力持續5 s，如果大鼠在5 s 內出現縮足，記錄相應等級克數為1個“+”，如未縮足，則記錄相應等級克數為1 個“-”；每個von-Frey 纖毛克數等級測試5 次，每次測試間隔5 min，5 次測試中出現3 次大鼠縮足反應（記作3 個“+”號），則停止向高一等級克數測試， 改為向低一等級克數重復測試，確定下一等級不出現3 個“+”號。 PWT 為首個出現3 個“+”的von-Frey 纖毛克數等級[10，14]。

2.5.2 HE 染色 （1）取材：用25%烏拉坦將大鼠深度麻醉后斷頭處死，并迅速將大鼠置于冰上進行取材。剪開局部皮膚，用手術剪在大鼠右股骨中段后方約1 cm 處，以平行于股骨的方向切開皮膚、暴露肌肉，再用尖頭彎鉗經過股二頭肌間隙對肌肉進行鈍性分離[11]，暴露坐骨神經，剝離包裹在坐骨神經周圍的軟組織，迅速剪取結扎部位上方5～10 mm 長度的坐骨神經，用生理鹽水沖洗，迅速置于裝有多聚甲醛的1.5 mL EP 管中進行后固定待用[10]。（2）包埋及切片：用石蠟對組織進行包埋，組織切片采用石蠟切片機。（3）HE 染色流程：修蠟塊、切片、展片、貼片、烤片（55～60 ℃）[10]，二甲苯2 min，100%無水乙醇2 min，95%乙醇2 min，80%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水2 min，Harrys 蘇木素1 min，自來水洗5 min，1%鹽水乙醇液分化30 s（分色），飽和碳酸鋰30 s，自來水2 min，蒸餾水2 min，0.5%伊紅5 min，蒸餾水速洗，95%乙醇2 min×2 次，100%乙醇2 min×2次，石碳酸二甲苯30 s，二甲苯3 min×3 次，中性封固樹膠。

3 結果

3.1 大鼠右后足PWT

與N 組相比，M 組大鼠的PWT 在造模后1 d出現下降（P＜0.05），3 d、7 d、10 d、14 d、17 d 持續降低（P＜0.01）并逐漸保持穩定，說明CCI 模型大鼠在造模后出現了機械痛覺過敏。

與造模前相比，T 組大鼠的PWT 在造模后1 d出現了明顯下降，在3 d 達到最低（P＜0.01），說明CCI 模型大鼠造模成功。 從第4 天起行按揉承山穴操作干預，至14 d，PWT 與造模前相比差異有統計學意義（7 d，P＜0.01；10 d、14 d，P＜0.05）；至17 d 與造模前差異無統計學意義（P＞0.05）。

與N 組相比，T 組大鼠的PWT 在CCI 造模術后有明顯降低（1 d、3 d、7 d，P＜0.01；14 d，P＜0.05），10 d 及17 d 的PWT 與N 組差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表1、圖1。

表1 各組大鼠右后足PWT 變化（±s，n=8，g）

表1 各組大鼠右后足PWT 變化（±s，n=8，g）

注：與N 組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與造模前相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別N 組M 組T 組造模前17.1±5.7 16.4±3.9 15.8±4.5造模后1 d 18.5±6.4 9.0±3.5*8.6±3.6**##造模后3 d 16.5±5.2 6.8±1.5**7.1±4.4**##造模后7 d 17.1±5.7 7.3±2.1**8.8±4.5**##造模后10 d 16.5±6.3 6.0±1.9**9.9±2.5#造模后14 d 17.8±5.1 6.0±1.1**10.1±2.2*#造模后17 d 16.4±3.9 6.5±2.1**12.0±3.3

圖1 各組大鼠右后足PWT 變化

3.2 各組大鼠坐骨神經HE 染色結果

坐骨神經切片HE 染色觀察可見：N 組大鼠坐骨神經橫切面完整，神經纖維排列緊密，神經纖維外膜、神經束膜及神經內膜完整，神經外膜較疏松且可見血管，神經突起被髓鞘包繞，髓鞘完整，未見脫髓鞘樣改變；M 組大鼠坐骨神經外膜及神經束膜增厚明顯，結構相對完整，神經內膜疏松碎裂，內可見血管，部分神經纖維呈脫髓鞘樣改變，髓鞘腫脹、分裂；T 組大鼠坐骨神經外膜及神經束膜增厚明顯，結構相對完整，神經外膜較致密，外可見結締組織包裹，神經內膜及外膜內均可見血管，神經內膜較疏松，可見裂隙，部分神經纖維呈脫髓鞘樣改變，部分髓鞘空泡狀，可見髓鞘完整的正常形態神經纖維。 詳見圖2～3。

圖2 各組大鼠坐骨神經HE 染色結果（×100）

圖3 各組大鼠坐骨神經HE 染色結果（×400）

4 討論

頸肩腰腿痛是中醫推拿科常見病種，全球頸肩腰腿痛發病率占疼痛疾病的50%～60%[15]，其中相當部分患者屬于神經病理性疼痛，諸如頸椎間盤突出癥、腰椎間盤突出癥、外周神經干或神經分支卡壓綜合征等[16]。 古籍中早有推拿鎮痛的理論記載，如《醫宗金鑒·正骨心法要旨》中載有：“按其經絡，以通郁閉之氣，摩其壅聚，以散瘀結之腫”，說明推拿是行氣止痛、消散瘀滯的要法[17-18]。 雖然臨床中推拿干預神經病理性疼痛有很好的鎮痛效果，但目前研究還存在不足，推拿手法鎮痛機制尚未明確。

目前，神經病理性疼痛研究的動物模型中，CCI模型是最常用的動物模型[19]。 承山穴為臨床治療腰腿痛穴位處方中出現頻次排名第五的腧穴[20]，承山穴作為針灸處方中的主穴，出現的頻率也較高[21]。WU 等[22]通過解剖研究發現，承山穴和坐骨神經之間通過感覺和運動通路相關聯，雖然承山穴和坐骨神經相關的感覺和運動神經源在標記數量上有所不同，但它們卻分布在相同的脊柱節段和中樞靶區。而曹乾安等[23]通過力敏腧穴探查發現，承山穴是腰痛患者的力敏穴位之一，承山穴的力敏閾值也隨治療過程中病情的緩解而逐漸升高。 胡濤濤[24]在其實驗研究中認為，神經功能恢復、再生神經纖維密度、再生神經髓鞘形成、腓腸肌恢復率等是坐骨神經損傷修復的重要指標。 基于以上研究基礎，本研究團隊認為，神經解剖學的連接可能是承山穴治療坐骨神經疾病作用機制的重要環節，推拿按揉承山穴有助于CCI 大鼠坐骨神經損傷的修復，從而達到鎮痛效應。

本實驗結果顯示，模型組大鼠在CCI 造模后1 d其PWT 即出現了降低，直至實驗結束，說明造模后大鼠出現了明顯的痛覺過敏現象。 按揉承山穴組大鼠的PWT 在造模后的1 d 和3 d 出現了明顯的下降，說明CCI 模型造模成功，術后第4 天起推拿按揉法介入，從術后7 d 開始，按揉承山穴組大鼠的PWT 有升高趨勢，尤其是10 d 和17 d 的PWT 接近正常水平，說明按揉承山穴對CCI 模型大鼠有顯著的鎮痛效應。坐骨神經HE 染色結果顯示，模型組大鼠的坐骨神經脫髓鞘明顯，而按揉承山穴組大鼠坐骨神經外膜及神經束膜較空白組有所增厚，結構相對完整，神經外膜較致密，外可見結締組織包裹，內含豐富血供，神經內膜較疏松，可見裂隙及部分神經纖維呈脫髓鞘樣改變，部分髓鞘空泡狀，可間見結構完整的神經纖維，說明按揉承山穴對坐骨神經的損傷起到了良性的作用。 本實驗研究結果表明，按揉承山穴有明確的鎮痛效應，且對損傷的坐骨神經形態學產生了一定的良性影響，其鎮痛機制可能與延緩周圍神經損傷及神經損傷脫髓鞘后髓鞘再生有關。本實驗為推拿手法鎮痛提供了一定的理論依據與實驗基礎，按揉承山穴鎮痛作用與神經損傷修復之間的關系還有待進一步深入研究。