邊疆少數民族彝族人群rs1333049單核苷酸多態性與冠心病的聯系*

劉 斌，張 敏，李顯剛，林仁華，楊 潔，張 亮，何 躍，王顯昆，潘婭楠

昆明醫科大學第五附屬醫院/紅河州滇南中心醫院：1.心血管內科；2.醫學檢驗科，云南個舊 661000

冠心病是炎癥介導、多種細胞因子參與，以冠狀動脈血管平滑肌內膜損傷和脂質沉積為病變基礎的動脈粥樣硬化缺血性心臟病，其受遺傳和環境因素的交互影響，并表現出地域、民族和種族差異[1]。染色體9p21上rs1333049 單核苷酸多態性(SNP)與冠心病有關聯[2]，但不同地域、不同民族間，民俗習慣、飲食結構、疾病普及遺傳基因有差異[3]，冠心病易感基因可能存在民族地域特征。云南省有25個少數民族，其中彝族人口數量最多，彝族群體以大雜居小聚居的居住方式零星分布于云南的各個地州，其中80%居住在高寒山區，彝族人群獨特的居住環境及民俗習慣可能與冠心病的發生有聯系，但目前國內外少見相關報道。本研究以中國少數民族種類最豐富的云南省為例，選取云南省少數民族人口數量最多的彝族人群作為研究對象，探討云南邊疆紅河哈尼族彝族自治州(以下簡稱紅河州)彝族人群染色體9p21上rs1333049 SNP與冠心病的聯系，并分析彝族冠心病的易感基因型，以了解多民族聚集區彝族人群冠心病的影響因素及易感基因，為少數民族冠心病的預防、控制及基因診斷提供參考資料，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年4月至2020年12月在昆明醫科大學第五附屬醫院住院的120例年齡>18歲，3代以內無不同民族間通婚，且居住在紅河州范圍內的非直系世居彝族人群作為研究對象，其中男65例，女55例，平均年齡(56.83+10.29)歲。選取經冠狀動脈造影檢查為陽性的60例作為冠心病組，男性占比58.3%，平均年齡(58.62±9.05)歲，納入標準滿足所有條件或者(1)/(2)+(3):(1)有心悸、胸悶/胸痛等臨床癥狀；(2)心電圖有ST-T段心肌缺血改變；(3)冠狀動脈造影檢查證實主要供血冠狀動脈管腔狹窄≥50%。按照性別年齡匹配，連續入選同期經臨床及冠狀動脈造影檢查排除了冠心病的彝族非冠心病患者60例作為對照組，男性占比50.0%，平均年齡(55.05±11.19)歲。排除標準：非世居彝族、有全身免疫功能障礙、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能障礙、合并嚴重感染、急性消化道出血、嚴重貧血、精神行為異常者。收集納入研究對象的性別、年齡、居住地、既往史、個人史、血壓[收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)]等基本信息，以及總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FBG)、同型半胱氨酸(Hcy)等指標和冠狀動脈造影檢查等結果。本研究通過昆明醫科大學第五附屬醫院倫理委員會批準,所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2相關診斷標準 高血壓[4]、糖尿病[5]的診斷依據臨床診治期間我國最新的臨床指南為標準；吸煙、飲酒史為有相應嗜好1年以上，吸煙：>100支/年,飲酒：每天飲用酒精量(g)男性、女性分別為>25 g、>15 g，酒精量(g)=飲酒總量(mL)×含酒精濃度(%)×0.8。血脂、血糖等生化指標為患者空腹>8 h采血，經定期室間質控及每天室內質控合格的AU5800生化分析儀(美國)檢測。

1.3樣本量的估算 本研究依據云南省玉溪市報道的彝族冠心病人群染色體9p21上rs1333049基因分布的頻率[6]，以基因型頻率占比最高(47%)的CG基因型、CG+GG基因型頻率占比為77%，結合前期對昆明醫科大學第五附屬醫院住院的彝族冠心病患病率的估算及rs1333049基因分布頻率的初步分析，以頻率最高(45%左右)的G等位基因、CG+GG基因型的累積頻率占70%左右，檢驗效能=0.8，檢驗水準α=0.05,1-α=0.95,根據PASS15.0樣本量估算軟件計算的樣本量為58例，失訪率按照5%計算，樣本量為每組各61例，取整數每組各60例。

1.4方法

1.4.1血液樣本收集 采集符合納入標準人群的靜脈血2 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝采血管收集后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4.2血液樣本DNA提取 采用Qiagen血液DNA提取試劑盒，按照說明書操作步驟提取全血DNA，采用UV-IV紫外分析儀(北京市新技術應用研究所生產)檢測A260/A280，若A>1.8為純度達標(>90%)，DNA樣本保存備用。

1.4.3rs1333049基因分型 染色體9p21上rs1333049基因分型采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)，引物設計用PrimerPremier6.0軟件完成，G等位基因5′到3′方向正向DNA序列：ATCATACCCGAA GTAGAGC，反向引物序列：TTGTTGAACAATTTCCCTA。以1.0 μmol/L的引物采用BIO-RAD公司生產的PTC-200 PCR儀進行基因擴增，PCR產物采用DYY-8C電泳儀進行檢測，純化的PCR產物用ABI3730XL型DNA測序儀(Applied Biosystems公司)進行基因分型，所有操作嚴格遵循標準操作規程，用chromas.exe軟件讀取基因測序的峰圖。

1.5數據收集 收集個人基本信息，從醫院信息系統調取住院患者入院第2天空腹血的血生化指標，冠狀動脈造影結果錄入自建的EpiDataV3.1冠狀動脈數據庫。

2 結 果

2.1等位基因Hardy-Weinberg平衡檢驗 冠心病組和對照組rs1333042 SNP等位基因頻率采用Hardy-Weinberg平衡χ2檢驗，P>0.05，表示樣本的民族群體代表性好。

2.2兩組人群基線資料比較 冠心病組和對照組人群高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒、FBG及rs1333042基因型比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；而年齡、男性、居住農村、SBP、DBP、LDL-C、HDL-D、TG、TC、Hcy及rs1333049等位基因比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 冠心病組和對照組基線資料比較[n(%)或或M(Q1,Q3)]

組別nDBP(mm Hg)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)FBG(mmol/L)Hcy(mmol/L)對照組6085.42±22.192.81±0.801.17±0.301.43(1.14,2.55)4.64±0.995.35±0.8612.42(10.50,16.14)冠心病組6083.98±14.352.98±0.941.11±0.331.73(0.99,2.23)4.63±1.436.44±2.0112.65(10.90,15.52)χ2/t/Z0.420-1.0901.071-0.0940.054-3.853-0.228P0.6750.2780.2860.9250.957<0.0100.819

組別nrs1333049基因型CCCGGGrs1333049等位基因CG對照組6017(28.3)22(36.7)21(35.0)56(46.7)64(53.3)冠心病組609(15.0)35(58.3)16(26.7)53(44.2)67(55.8)χ2/t/Z6.1020.151P0.0470.679

2.3彝族人群染色體9p21上rs1333049的基因分布特征 冠心病組rs1333049的CG基因型頻率(58.3%)高于對照組(36.7%)，而CC及GG基因型頻率均低于對照組(15.0%vs.28.3%、26.7%vs.35.0%)，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1；而不同性別人群rs1333049的CC、CG、GG基因型頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖2；不同年齡(≤45歲、>45～65歲、>65歲)人群rs1333049的CC、CG、GG基因型頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖1 兩組彝族人群rs1333049基因型頻率比較

圖2 彝族不同性別人群rs1333049基因型頻率比較

圖3 彝族不同年齡人群rs1333049基因型頻率比較

2.4彝族冠心病主要危險因素分析 采用多因素Logistic回歸分析將冠心病相關因素：性別、年齡、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、LDL-C、表1中差異有統計學意義的FBG及染色體9p21上rs1333049基因型(CC、CG、GG)賦值后納入回歸分析模型，因變量為是否為冠心病，冠心病賦值1，非冠心病(對照組)賦值0。結果顯示，年齡(OR=1.054，95%CI：1.009～1.101)、FBG(OR=1.741，95%CI：1.156～2.623)、rs1333049的CG基因型(OR=4.160，95%CI：1.399～12.370)為彝族冠心病的影響因素(P<0.05)。見表2。

表2 彝族冠心病多因素Logistic回歸分析

2.5年齡、FBG診斷彝族冠心病的ROC曲線分析 ROC曲線分析結果顯示，年齡>61.5歲，曲線下面積(AUC)=0.615,P=0.029;FBG>6.06 mmol/L,AUC=0.644,P=0.006。年齡、FBG診斷彝族冠心病的靈敏度為分別為45.0%、41.7%，特異度分別為87.3%、89.9%，2項指標聯合檢測診斷冠心病的AUC=0.719，P<0.001，靈敏度為65.0%，特異度為73.3%。見圖4。

圖4 年齡、FBG預測彝族冠心病患者的ROC曲線

3 討 論

冠心病是邊疆少數民族地區導致死亡和傷殘的主要疾病之一，但目前缺乏大規模的流行病學調查報告。對于彝族等少數民族，因冠心病的診治費用高[7]、需要長期服藥的特點成為邊疆脫貧攻堅的難點。冠心病的發病受地域、環境、民族、飲食習慣、生活方式和遺傳背景的交互影響[8]。彝族等少數民族冠心病的危險因素及冠心病的相關易感基因是否與其他民族存在差異，相關報道較少。有研究顯示，特定基因型的效應大小可能與遺傳背景及環境因素密切相關[9]。在北印度人群中，rs1333049 的C/G多態性與冠心病明顯相關，CC純合基因型的頻率與冠狀動脈嚴重程度呈正相關[10]。來自英國、比利時和波蘭的全球急性冠狀動脈事件登記研究共納入3 247例急性冠脈綜合征患者，隨訪6個月，發現rs1333049位點C等位基因與心肌梗死復發或心源性死亡獨立相關(HR=1.49,95%CI：1.03～1.98,P=0.028)[11]。對波蘭白種人急性ST段抬高型心肌梗死患者的5年隨訪研究未發現rs1333049基因型與全因病死率相關，但高危冠心病組rs1333049位點的GG/CG基因型與5年生存率相關(HR=2.3,95%CI：1.2～4.3,P=0.015)[12]；來自中國、韓國、日本3國共20 523例入選病例的薈萃分析也證實rs1333049 SNP與冠心病有關聯(OR=1.29，95%CI：1.23～1.36，P=0.001)[13]，但相關研究未探討少數民族SNP與冠心病的聯系。在中國新疆維吾爾族人群中，冠心病易感基因rs1333049以CC基因型及C等位基因為主[14]，昆明漢族[15]與溫州漢族[16]均以CG/CC基因型及C等位基因高表達為主。而本研究發現，彝族冠心病CG基因型呈高表達(>50%)，CG基因型是彝族人群冠心病的易感基因型(OR=4.160，95%CI：1.399～12.370)，而兩組C、G等位基因頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示不同地區、不同民族間基因頻率及易感基因型有差異，其原因需進一步研究。

本研究結果顯示，性別、年齡、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、LDL-C、FBG及染色體9p21上rs1333049基因型是彝族人群患冠心病的相關因素，以上相關因素與漢族冠心病的相關因素相似，在邊疆少數民族彝族人群中，年齡(OR=1.054，95%CI：1.009～1.101)、FBG(OR=1.741，95%CI：1.156～2.623)為冠心病的影響因素，但其單獨診斷冠心病的靈敏度、特異度較低，考慮這2項指標為冠心病的非特異性指標，且有交互影響作用。年齡和FBG聯合檢測預測冠心病的效率有所提升，提示對于邊疆少數民族，根據人群年齡，關注患者FBG，可能對冠心病的早期識別和預防有一定意義。

對于多民族聚集的云南邊疆少數民族地區，其獨特的山區地形、溫和的氣候條件、豐富多彩的民族文化、頻繁的邊境商貿人員往來，可能使少數民族集聚區冠心病的易感基因及基因型表現有所不同。本研究結果顯示，云南邊疆彝族人群rs1333049 SNP符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，提示樣本的民族代表性較好。本研究發現，不同性別、不同年齡彝族人群rs1333049的基因型頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。冠心病組CG基因型頻率(58.3%)高于對照組(36.7%)，多因素Logistic回歸分析校正高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒后，rs1333049的CG基因型為彝族冠心病的獨立危險因素(OR=4.160，95%CI：1.399～12.370，P<0.05)，提示rs1333049的CG基因型與彝族冠心病的發病有關聯，相似的研究結論在白種人、黑種人、亞洲黃種人中均得到證實[17]。

彝族人群染色體9p21上rs1333049 SNP與冠心病有關聯[18]，但易感基因型與漢族人群有差異，其可能與彝族人群的遺傳背景、居住環境、風俗習慣、生活方式、飲食結構和疾病譜有關，但需進一步研究。云南世居彝族80%居住在山區，山區高海拔及相對缺氧的高原環境可能對遺傳變異及飲食習慣有影響，本研究未進行探討，后續研究者可進一步探索。本研究入選的彝族人群均為3代以內不存在非彝族間通婚的情況，以保證同民族間基因遺傳的穩定性，但入選人群70%以上居住在農村，其余近30%人群由于城鎮化由農村移居城鎮，城鎮彝族居民的生活方式、飲食結構及行為習慣可能受人口數量最多的漢族人群的影響，其冠心病的易感基因型也可能會隨環境及生活方式的改變而發生變化。染色體9p21上rs1333049 C/G 位于 CDKN2B-AS1 的非翻譯區，其通過編碼細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKN )2A和CDKN2B或甲基硫腺苷磷酸化酶通路，引起反義非編碼RNA的轉錄抑制、染色質重塑、炎癥介導、基因沉默或DNA甲基化[19]，從而引起堿基插入、缺失或突變，加速冠心病易感基因型改變，促進動脈粥樣硬化的進程，但確切的分子機制還需進一步研究。

本研究經過嚴格的試驗設計和倫理審查，樣本量的估算以前期大量的文獻調研并結合實際臨床實踐為基礎，通過專業的PASS15.0軟件進行樣本量估算；入組者嚴格按照前瞻性試驗設計入組，入組者排除非彝族通婚及家族性遺傳病者，入組人群代表性較好。冠心病組所有患者均行冠狀動脈造影檢查確診，對照組經臨床診斷明確排除冠心病，但由于樣本量較小，入選病例可能難免有入組偏倚；對照組并非完全健康人群，基礎疾病的交互影響可能成為冠心病的混雜因素；由于樣本量有限，且為單中心的少數民族研究，研究結論可能具有地域特征，但對了解多民族聚集區少數民族冠心病的危險因素具有啟發作用。世居彝族人群多居住在山區，但入組人群有近30%居住在城鎮(由農村移居城鎮)，其彝族人群原本的基因背景可能會隨著環境、生活方式及行為習慣的改變而發生變化，本研究未進一步分析居住地及生活方式改變等可能引起的基因變異問題，后續可開展多中心、大樣本的前瞻性研究，盡可能多地控制可能的混雜因素，使研究更具代表性。