預凍后凍藏溫度對金鯧魚品質的影響

梁釋介，孫曉悅，李 晴，馮淳淞，洪 惠，譚雨青，羅永康

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

金鯧魚，學名卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus），是我國重要的海洋經濟魚類[1]。因其營養豐富、肉質細嫩且味道鮮美，而深受消費者歡迎。近年來，金鯧魚的人工養殖產量逐年遞增，2022中國漁業統計年鑒數據[2]顯示，2021年我國金鯧魚養殖產量達到243 908 t，較2020年金鯧魚養殖產量增長139.85%，位列海水魚養殖產量第2名。

金鯧魚具有豐富的營養物質且水分含量較高，在捕撈后的運輸和銷售過程中容易滋生細菌并迅速劣變，因此在貯運過程中常采用低溫保鮮。目前市場上主要采用冰鮮和真空包裝冷凍2 種保鮮方式[3]。冰鮮可以延緩金鯧魚品質劣變并確保新鮮度，但是貯藏時間較短，而真空包裝冷凍的貯藏時間較長，因此金鯧魚遠距離銷售一般以凍品形式。凍結過程中會有冰晶形成，引起細胞破裂、肌肉纖維變形，從而導致魚肉水分流失、蛋白質氧化、品質下降等問題[4-6]。有研究表明，冰晶大小和分布受凍結速率、凍結溫度和凍藏溫度影響[7-8]。Cai Luyun等[9]研究發現先于-55 ℃完全凍結后，再置于-18 ℃凍藏的日本鱸魚魚肉品質優于普通凍結處理后凍藏的魚肉；李秀霞等[10]研究發現-40 ℃超聲輔助冷凍處理海鱸魚片凍結速率快、冰晶小且分布均勻，能夠有效降低肌原纖維蛋白氧化程度；鞏濤碩等[11]研究發現螺旋式凍結處理的金鯧魚肉肌原纖維間隙小、分散均勻，組織冰晶細小，品質優于其他凍結方式。

目前研究大多聚焦于凍結速率、凍結溫度與凍結方式對貯藏期間魚肉品質的影響，而對于預先冷凍處理后，凍藏溫度對其品質影響的研究較少；此外，目前絕大多數研究聚焦于金鯧魚魚片在貯藏期間品質變化，然而在實際運輸貯藏過程，金鯧魚一般以整魚形式進行。因此，研究預先冷凍處理，再置于不同溫度貯藏對金鯧魚整魚品質的影響，可以為其品質控制提供理論依據，對促進金鯧魚貯運和銷售具有重要現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金鯧魚（平均體質量（0.72f0.01） kg）由海南藍糧科技有限公司提供，捕獲后24 h內冷鏈空運至北京實驗室。將金鯧魚隨機分為2 組，每組30 條，整魚真空包裝后置于低溫冷凍冰箱（-40 ℃）中預凍24 h，隨后分別于-20、-40 ℃冰箱中冷凍貯藏。每隔4 周，從每組隨機抽取3 條金鯧魚放入4 ℃冰箱解凍24 h。解凍后進行感官評定，然后取背部肉進行其余指標測定。

哌嗪-1,4-二乙磺酸（piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES）、氨丁三醇（trometamol，Tris）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙醛2,4-二硝基苯腙（acetaldehyde 2,4-dinitrophenylhydrazone，DNPH）美國Sigma公司；亞硫酸鈉、無水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、馬來酸、尿素、無水乙醇、乙酸乙酯、鹽酸胍、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、濃鹽酸、5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNPH）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、2,6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、溴酚藍（bromophenol blue，BPB） 國藥集團化學試劑有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BD-151WGHES冷凍冰箱 青島海爾集團；DW-FL270低溫冷凍冰箱 安徽中科美菱低溫科技股份有限公司；T10分散均質機 德國IKA公司；FE-20 pH計 上海梅特勒-托利多科技有限公司；TGL16A冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；F97熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司；14886真空包裝機 寧波得力集團有限公司；ST5020全自動染色機 德國Leica儀器有限公司；Pannoramic MIDI病理掃描儀 山東斯瑞締醫療科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 感官評價

參考GB/T 18108ü2019《鮮海水魚通則》[12]的方法，略作修改。感官評定人員由10 人（3 男7 女）組成，每位評定人員對解凍后的金鯧魚進行感官評價，評價指標包括魚體、肌肉、魚眼、魚鰓及蒸煮品質。感官評價結果以平均分表示，并計算感官總得分，總分30 分表示絕對新鮮，低于15 分表示已發生較明顯的腐敗。

表1 金鯧魚感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of golden pomfret

1.3.2 離心損失率的測定

取2 g背部肉放入50 mL離心管中，準確記錄魚肉質量m1（g），離心管中提前放入玻璃珠和濾紙。將離心管在冷凍離心機中離心（4 ℃、1 590hg、10 min）。稱量離心后魚肉質量m2（g）。按式（1）計算離心損失率。

1.3.3 肌原纖維蛋白的制備

參考Liu Ru等[13]的方法。取2 g攪碎魚肉于50 mL離心管中，加入15 mL去離子水（4 ℃），冰浴均質30 s后低溫離心（10 000hg、10 min）。離心后棄去上清液，向沉淀中加入15 mL 0.3% NaCl（m/m）溶液（4 ℃），冰浴均質30 s，低溫離心（10 000hg、10 min）。棄去上清液，向沉淀中加入30 mL Tris-馬來酸緩沖液（0.6 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-馬來酸，pH 7.0），冰浴均質30 s，將勻漿液放置于4 ℃冰箱，靜置1 h，然后離心（4 ℃、10 000hg、10 min），上清液即為肌原纖維蛋白溶液。用0.6 mol/L NaCl（pH 7.0）調節蛋白質量濃度，存放于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 總巰基含量與二硫鍵含量測定

參考盧涵[14]的方法。

總巰基含量：取0.5 mL 4 mg/mL肌原纖維蛋白溶液，加入4.5 mL緩沖液A（0.2 mol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素、3 mmol/L EDTA、1% SDS，pH 8.0），充分混勻后，取4 mL混合液，加入0.5 mL緩沖液B（10 mmol/L DTNB-10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0），于40 ℃下孵育25 min，室溫下冷卻后于412 nm波長處測定其光密度，空白組用0.6 mol/L NaCl（pH 7.0）代替蛋白質溶液，所用摩爾吸光系數為13 600 L/（molgcm）。按式（2）計算總巰基含量，結果以蛋白計。

式中：OD空白為空白組的光密度；OD樣品為樣品的光密度。

二硫鍵含量：將緩沖液A換為緩沖液C（0.2 mol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素、3 mmol/L EDTA、1% SDS、0.1 mol/L亞硫酸鈉，pH 8.0），將緩沖液B換為緩沖液D（0.2 mol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素、3 mmol/L EDTA、1% SDS、0.1 mol/L亞硫酸鈉、10 mmol/L NTSB，pH 9.5），其余步驟同上。按式（3）計算二硫鍵含量，結果以蛋白計。

式中：OD空白為空白組的光密度；OD樣品為樣品的光密度。

1.3.5 羰基含量測定

參考Oliver等[15]的方法。取1 mL 4 mg/mL肌原纖維蛋白溶液，加入1 mL 10 mmol/L DNPH-2 mol/L鹽酸溶液，避光反應1 h（每15 min漩渦振蕩1 次）。反應完畢后加入1 mL 20 g/100 mL TCA溶液終止反應并離心（14 000hg，5 min）。棄去上清液后，沉淀用乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）洗滌3 次。洗滌后的沉淀用3 mL 6 mol/L鹽酸胍-2 mol/L鹽酸溶解并于37 ℃水浴鍋中孵育15 min。室溫下冷卻后于370 nm波長處測定溶液光密度，空白組用0.6 mol/L NaCl（pH 7.0）代替蛋白溶液。摩爾吸光系數為22 000 L/（molgcm）。按式（4）計算羰基含量，結果以蛋白計。

式中：OD空白為空白組的光密度；OD樣品為樣品的光密度。

1.3.6 表面疏水性的測定

參考Utrera等[16]的方法，略作調整。將200 μL 1 mg/mL BPB加入1mL 5 mg/mL肌原纖維蛋白溶液中，空白組用1 mL PIPES緩沖溶液（50 mmol/L PIPES，0.3 mol/L NaCl，pH 6.25）代替蛋白質樣品。在室溫下攪拌10 min后，低溫離心（4 ℃、2 000hg、15 min）。取上清液稀釋20 倍后于595 nm波長處測定其光密度。表面疏水性由BPB結合量表示。按式（5）計算表面疏水性。

式中：OD空白為空白上清液的光密度；OD樣品為樣品上清液的光密度。

1.3.7 內源熒光強度的測定

參考Ren Lina等[17]的方法，略作調整。取0.05 mg/mL肌原纖維蛋白溶液，用熒光分光光度計測定。參數設置為：激發波長295 nm，激發和發射狹縫寬度均為10 nm，發射波長掃描范圍為300～500，掃描速率6 000 nm/min。每個樣品做3 個平行，每個平行掃描2 次。

1.3.8 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARs）值的測定

參考Duan Jingyun等[18]的方法。取2 g絞碎的魚肉加入16 mL 5 g/100 mL TCA溶液，再加入100 μL 2 g/L BHT-乙醇，勻漿30 s然后離心（5 000hg、3 min）。取5 mL上清液加入1 mL 0.01 mol/L TBA，混勻后沸水浴40 min，取出后置于冰水浴中快速降溫，于532 nm波長處測定OD532nm，結果以每千克樣品所含丙二醛（malondialdehyde，MDA）質量計。按式（6）計算TBARs值。

1.3.9 組織微觀結構觀察

參考Li Qing等[19]的方法，略作調整。將金鯧魚背部肌肉沿著肌原纖維的紋理水平和垂直切割，置于4%的組織固定溶液中浸泡24 h。肌肉在無水乙醇和80%、70%乙醇溶液中脫水，并用石蠟包埋。對樣品進行切片，厚度約為5 μm，切片用蘇木精和伊紅溶液染色。使用250 倍放大的病理圖像掃描儀對金鯧魚肌肉的微觀結構進行拍照。

1.4 數據處理

各個指標均進行3 次平行實驗，所有實驗數據使用Microsoft Office Excel 2019進行處理，結果以平均值±標準差表示，使用SPSS 26.0軟件進行顯著性分析，選擇單因素方差分析中的Tukey-test，置信區間取95%（P＜0.05）。使用Microsoft Office Excel 2019作圖。

2 結果與分析

2.1 金鯧魚的感官評價結果

由表2可知，新鮮金鯧魚在魚體、肌肉、魚眼、魚鰓、蒸煮實驗及感官總分的初始評分分別為5.83、5.70、5.57、5.70、5.77和28.58。隨著凍藏時間延長，各感官指標評分均呈下降趨勢。第24周時，-20 ℃和-40 ℃凍藏的金鯧魚魚體與肌肉感官評分出現顯著差異（P＜0.05），其余指標的感官評分沒有出現顯著差異。任何一個指標感官評分低于3 分或感官總評分低于15 分則認為感官不可接受，而在整個貯藏期間2 組金鯧魚各感官指標均未低于限值，因此在24 周的凍藏時間內，-20 ℃和-40 ℃凍藏的金鯧魚均保持良好的感官品質。在整個貯藏期間，-20 ℃凍藏的金鯧魚的感官總評分均低于-40 ℃條件下凍藏的金鯧魚，并在第20周與第24周出現顯著差異（P＜0.05），說明降低凍藏溫度能夠延緩金鯧魚在貯藏過程中感官品質下降。

表2 金鯧魚在不同溫度凍藏過程中感官評分的變化Table 2 Sensory changes of golden pomfret during frozen storage at different temperatures

2.2 金鯧魚肉的離心損失

由圖1可知，新鮮金鯧魚肉的離心損失率為8.07%，隨著凍藏時間延長，2 組金鯧魚肉的離心損失率均呈上升趨勢，在第24周，-20、-40 ℃凍藏的金鯧魚離心損失分別為27.73%和25.01%。-20 ℃凍藏的金鯧魚在整個凍藏期間離心損失率均高于-40 ℃，但無顯著差異（P＞0.05）。在冷凍過程中，魚肉中的水分會形成冰晶，可能引起魚肉肌原纖維蛋白變性，進而導致水分流失。結果表明經過預凍后不同凍藏溫度對金鯧魚肉的離心損失率無顯著影響。

圖1 金鯧魚在不同溫度凍藏過程中離心損失的變化Fig. 1 Changes in centrifugal loss of golden pomfret during frozen storage at different temperatures

2.3 金鯧魚肉肌原纖維蛋白總巰基含量

總巰基含量是評價蛋白質氧化程度的重要指標，巰基會被氧化成二硫鍵及其他氧化產物[20]。由圖2可知，不同凍藏溫度下金鯧魚肉肌原纖維蛋白的總巰基含量均呈現下降趨勢。2 組金鯧魚肉肌原纖維蛋白的巰基含量在凍藏前4 周快速下降，隨后緩慢下降，相較于初值分別下降48.2%及44.5%。-20 ℃凍藏條件下金鯧魚肉肌原纖維蛋白的總巰基含量在貯藏過程中都低于-40 ℃凍藏的樣品，但差異不顯著（P＞0.05）。表明經過預凍后不同凍藏溫度對金鯧魚肉肌原纖維蛋白的總巰基含量減少的影響較小。

圖2 不同溫度凍藏過程中金鯧魚肉肌原纖維蛋白總巰基含量的變化Fig. 2 Changes in total sulfhydryl content of myofibrillar proteins in golden pomfret muscle during frozen storage at different temperatures

2.4 金鯧魚肉肌原纖維蛋白二硫鍵含量

由圖3可知，經2 種溫度凍藏的金鯧魚肉肌原纖維蛋白二硫鍵含量隨凍藏時間延長均呈上升趨勢，且第24周的二硫鍵含量顯著高于第1周（P＜0.05），這與總巰基含量的下降相對應，這說明在凍藏期間肌原纖維蛋白逐漸被氧化。凍藏24 周后，-20、-40 ℃凍藏條件下金鯧魚肉肌原纖維蛋白的二硫鍵含量分別為3.24、3.69 mol/105g，相較于初值分別增加61.2%及83.6%，但不同溫度凍藏的金鯧魚肉肌原纖維蛋白的二硫鍵含量無顯著差異（P＞0.05），表明經過預凍后不同凍藏溫度對金鯧魚肉肌原纖維蛋白二硫鍵形成的影響較小。

圖3 不同溫度凍藏過程中金鯧魚肉肌原纖維蛋白二硫鍵含量的變化Fig. 3 Changes in disulfide bond content of myofibrillar protein in golden pomfret muscle during frozen storage at different temperatures

2.5 金鯧魚肉肌原纖維蛋白的羰基含量

羰基含量是評價蛋白質氧化程度最重要的指標之一，是特定氨基酸氧化修飾的重要產物。由圖4可知，在凍藏前4 周，-20 ℃與-40 ℃凍藏的樣品羰基含量均無明顯變化。隨后，2 個溫度凍藏的樣品的羰基含量均呈現增加趨勢，并且在凍藏第8周急劇上升。這與馬新悅等[21]研究的凍藏小黃魚的結果類似。凍藏金鯧魚肉肌原纖維蛋白的羰基含量最初為4.40 nmol/mg，凍藏20 周后，-20 ℃金鯧魚肉肌原纖維蛋白的羰基含量為29.36 nmol/mg，之后略微下降，在24 周時羰基含量為24.95 nmol/mg，此時-40 ℃下金鯧魚肉肌原纖維蛋白的羰基含量為26.04 nmol/mg。羰基含量上升說明在凍藏過程中魚肉蛋白發生了氧化，且隨凍藏時間的延長，氧化程度不斷加深，但經過預凍后不同溫度凍藏的金鯧魚肉肌原纖維蛋白的羰基含量無顯著差異。

圖4 不同溫度凍藏過程中金鯧魚肉肌原纖維蛋白羰基含量的變化Fig. 4 Changes in carbonyl content of myofibrillar proteins in golden pomfret muscle during frozen at different temperatures

2.6 金鯧魚肉肌原纖維蛋白的表面疏水性

表面疏水性反映蛋白表面疏水性氨基酸的暴露情況，預示蛋白質空間構象的改變。由圖5可知，金鯧魚肉肌原纖維蛋白的BPB結合量初值為24.85 μg，不同凍藏溫度下金鯧魚肉肌原纖維蛋白的表面疏水性在貯藏前12 周呈上升趨勢，-20、-40 ℃貯藏下金鯧魚肉肌原纖維蛋白的BPB結合量上升至49.00 μg和54.33 μg，隨后緩慢下降。桑燕菲等[22]研究也發現凍藏小龍蝦的表面疏水性先上升后下降。表面疏水性的升高可能是由于凍藏過程中蛋白質發生氧化變性，使得蛋白質空間結構逐漸展開，導致隱藏于蛋白內部的疏水性氨基酸暴露[23]。貯藏后期表面疏水性下降可能是由于展開的蛋白質分子發生進一步聚集，使暴露的疏水部分被掩蓋[24]。有研究發現凍藏過程發生的蛋白質側鏈氧化會導致蛋白質之間疏水作用力增強，使得表面疏水性下降[25-26]。不同溫度凍藏的金鯧魚肉肌原纖維蛋白的表面疏水性之間無顯著差異（P＞0.05），表明經過預凍后金鯧魚肉肌原纖維蛋白結構變化是隨著凍藏時間的延長而逐漸發生，受凍藏溫度的影響較小。

圖5 不同溫度凍藏過程中金鯧魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的變化Fig. 5 Changes in surface hydrophobicity of myofibrillar proteins in golden pomfret muscle during frozen at different temperatures

2.7 金鯧魚肉肌原纖維蛋白內源熒光強度

內源熒光光譜技術可用來監測蛋白質分子三級結構，通過測定色氨酸殘基的內源熒光圖譜來表征肌原纖維蛋白的構象變化及氧化程度[27]。由圖6可知，在-20、-40 ℃凍藏的金鯧魚肉肌原纖維蛋白的內源熒光強度都在貯藏前8 周內出現大幅度降低，隨后緩慢降低。Lefevre等[28]研究發現內源熒光強度的降低與色氨酸吲哚側鏈的變性和暴露相關。熒光強度的逐漸降低表明凍藏會導致金鯧魚肉肌原纖維蛋白色氨酸殘基的暴露和三級結構的變化[30]。在第24周時，在-20、-40 ℃凍藏的金鯧魚肉肌原纖維蛋白的內源熒光強度分別下降64.80%和57.34%。結果表明降低凍藏溫度能夠保護金鯧魚肉肌原纖維蛋白變性和結構變化程度。

圖6 不同溫度凍藏過程中金鯧魚肉肌原纖維蛋白內源熒光強度的變化Fig. 6 Changes in intrinsic fluorescence intensity of myofibrillar proteins in golden pomfret muscle during frozen at different temperatures

2.8 金鯧魚肉的TBARs值變化結果

在凍藏期間魚肉中不飽和脂肪酸會氧化生成MDA、酮、脂肪酸等，其中MDA與TBA反應生成粉色化合物，因此常用TBARs值判斷脂肪氧化程度[30]。由圖7可知，不同凍藏溫度下金鯧魚肉的TBARs值在凍藏期間略有波動，但總體呈上升趨勢，這說明隨著凍藏時間延長金鯧魚肉發生了脂肪氧化反應。凍藏金鯧魚肉的TBARs初始值為0.88 mg/kg，在第24周時達到最高值，-20、-40 ℃凍藏的金鯧魚肉的TBARs值分別為1.56 mg/kg和1.62 mg/kg。不同凍藏溫度下金鯧魚肉的TBARs值無顯著差異(P＞0.05)，表明經過預凍后不同凍藏溫度對金鯧魚肉脂肪氧化反應影響較小。

2.9 金鯧魚肉組織微觀結構變化結果

由圖8可知，新鮮金鯧魚肉肌纖維的橫切面和縱切面形狀固定、排列有序、間隙最小。經過24 周的凍藏，2 種溫度凍藏的金鯧魚肉肌纖維發生了變形，肌纖維間隙和斷裂程度明顯變大，但2 組之間無明顯差異。金鯧魚肉的品質和持水力可以通過肌肉組織的微觀結構來反映[31]，離心損失結果顯示，凍藏24 周后金鯧魚肉的持水力嚴重下降，但2 組之間無顯著差異，這與肌肉組織微觀結構結果相符。結果表明，隨著凍藏時間延長，金鯧魚肉肌纖維會發生劣變，導致魚肉持水力減弱、品質下降，但預凍后經過不同溫度凍藏對金鯧魚肌肉組織微觀結構無明顯影響。

3 結 論

經-40 ℃預凍后于-20、-40 ℃凍藏，2 組金鯧魚整魚的感官、魚肉持水力無明顯差異。蛋白氧化指標以及脂肪氧化指標結果表明，經預凍后不同溫度凍藏對肌原纖維蛋白的氧化變性與脂肪的氧化分解無顯著影響。凍藏24 周的金鯧魚肉的肌纖維縫隙和斷裂程度增大，但不同貯藏溫度魚肉之間的組織微觀結構無明顯差異。綜上所述，經過-40 ℃預凍處理后，相較于-20 ℃，-40 ℃凍藏不能有效延緩金鯧魚整魚的品質劣變。因此從節能角度考慮，經預凍后金鯧魚整魚冷凍凍藏溫度選擇-20 ℃。