褐藻多酚對低溫火腿腸品質的影響

張 晨，王 偉，吳 昊，解萬翠，李紅燕，董秀芳,3,*

（1.青島科技大學海洋科學與生物工程學院，山東 青島 266042；2.臨沂金鑼文瑞食品有限公司，山東 臨沂 276036；3.大理大學公共衛生學院，云南 大理 671000）

低溫肉制品是指在常壓下通過蒸、煮、熏、烤等熱處理，使中心溫度達到75～85 ℃的肉制品[1]。與高溫肉制品相比，低溫肉制品能夠保持原料肉固有的組織結構，使其肉質緊實有彈性，同時具有較高的蛋白消化率，符合現代人對健康飲食的需求。然而，由于產品殺菌溫度較低且含有豐富的蛋白質和脂肪，在運輸、貯藏過程中極易造成微生物污染、氧化變質，使產品品質和營養價值嚴重下降，通常表現為風味惡化、產品變色[2-4]。因此，尋找控制肉制品貯藏中微生物污染和蛋白質氧化的有效方法非常必要[5]。

多酚因其來源廣泛、抗氧化性和抑菌性突出被認為是最有前景的一類天然防腐添加劑和抗氧化劑，已在肉制品品質提升相關研究中被大量報道。褐藻是一種富含酚類物質的大型海藻，具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抑菌等[6]。褐藻多酚（phlorotannins，PT）是褐藻次級代謝產生的以間苯三酚為結構單元的聚合物[7]。目前，已有不少PT抗氧化性和抑菌性的評估，如Cui Xin等[8]發現海帶發酵液具有顯著的抗氧化活性。盧虹玉等[9]通過溶劑萃取和超濾方法提取4 種PT，并證實其具有顯著的抗氧化作用。李靜等[10]發現海帶中的PT對哈維氏弧菌和溶藻弧菌有明顯的抑制效果。許多種類多酚因具有良好的抗氧化和抑菌性活性被應用在肉制品中[11-17]，其中有不少關于PT在肉制品中的應用，如Wang Tiantian等[18]研究PT、α-生育酚和抗壞血酸對紅鯛魚在-18 ℃冷凍90 d后脂質和蛋白質氧化及質構特性的影響，發現PT和α-生育酚顯著降低硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARs）值，有效抑制蛋白質和脂質氧化。林嬌芬等[19]發現海帶多酚提取物可以顯著延緩對蝦TBARs值的上升，降低腐敗劣變的速度。Cox等[20]將海藻添加到肉餅中，發現能夠抑制肉餅氧化的發生及細菌的生長，感官可接受程度高。以上研究表明，PT作為抗氧化劑添加到食品中具有良好的應用前景，但添加到低溫肉制品中的研究鮮有報道。

加速貯藏實驗（accelerated shelf-life testing，ASLT）被廣泛應用于食品行業，通過模擬食品在不同環境下的變化，評估食品加速貯藏過程中的品質降低和保質期變化。相對于常溫保質期模擬測試方法，ASLT具有周期短、效率高的特點，現已廣泛應用于多種耐貯藏食物[21-23]。黃梅香等[24]通過ASLT模型，于37、32、27 ℃下推測低鈉鹽火腿腸在室溫25 ℃和低溫4 ℃的保質期。符鋒等[25]利用ASLT模型，預測了52、62 ℃下自熱菜肴竹筍肌肉在25 ℃的保質期。因此，本研究采用ASLT方法，以低溫火腿腸為食品加工模型，分別添加0.02%、0.10%質量分數的PT，從感官評價、TBARs值、菌落總數、電子鼻四個方面分析低溫火腿腸在貯藏期間的品質變化規律，并依照化學動力學原理進行保質期預測，以期為PT在低溫肉制品的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬瘦肉、肥膘、玉米淀粉、食鹽、白糖、味精、生姜粉、胡椒粉、花椒粉、卡拉膠、復合磷酸鹽、紅曲紅 青島市市北區開平路農貿市場。

PT 陜西帕尼爾生物科技有限公司；硫代巴比妥酸、無水乙醇、氯化鈉、三氯乙酸、氯仿 上海麥克林生化科技有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Spark 20M酶標儀 瑞士Tecan公司；HD-3A水分活度儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；PEN3型電子鼻德國Airsense儀器公司；FCD-3000電熱鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；FSH-2高速勻漿機 常州國華電器有限公司；Happy-TL20臺式高速冷凍離心機濟南福的機械有限公司；FA1004B電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫火腿的制備

參考張俊等[23]低溫火腿腸配方并適當修改，具體配方（所有調味料添加量以豬肉的總質量為基準）如下：對照組：豬瘦肉70%、肥肉30%、玉米淀粉6%、大豆分離蛋白3%、復合磷酸鹽0.4%、食鹽2%、卡拉膠0.4%、白糖1.5%、冰水25%、其他調味料0.8%（味精、生姜粉、胡椒粉、花椒粉）、紅曲紅0.3%。實驗組：分別添加0.02%和0.10%質量分數的PT，其余材料同對照組。

工藝流程：原料肉預處理→攪拌、腌制（4 ℃、24 h）→斬拌→灌腸封口→蒸煮滅菌→冷卻→成品→貯藏

操作要點：1）攪拌、腌制：瘦肉用食鹽、復合磷酸鹽、糖、5%冰水混合腌制；肥肉用食鹽腌制。攪拌過程中控制溫度于10 ℃左右，攪拌完成的肉糜置于容器中，排盡表面氣泡，置于4 ℃冰箱腌制24 h。2）斬拌：先后在肉糜中加入玉米淀粉、大豆分離蛋白、卡拉膠、白糖、香辛料及紅曲紅進行手動攪拌，玉米淀粉加水分散后加入，卡拉膠用熱水融化冷卻后加入，斬拌過程中加入冰水。3）蒸煮殺菌：將灌裝完成的低溫火腿腸置于沸水浴中恒溫蒸煮30 min，保持火腿腸中心溫度在75～85 ℃[26]。

1.3.2 感官評價

由10 名專業人士組成感官評價小組，對低溫火腿腸的色澤、外觀狀態、組織狀態、氣味4 項指標進行分項評分，計算總和與均值。每項指標分3 個等級。低溫火腿腸感官評分標準如表1所示。

表1 低溫火腿腸感官評價評分規則[23]Table 1 Criteria for sensory evaluation of low-temperature sausage[23]

1.3.3 TBARs值測定

參照GB 5009.181ü2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》的方法測定TBARs值。

1.3.4 電子鼻檢測

測定3 組低溫火腿腸的整體氣味特征，電子鼻傳感器響應類型見表2。取切碎后的待測樣品1 g于棕色計量瓶中，加入5 mL飽和氯化鈉溶液，搗碎后蓋上蓋子，用封口膜封好防止漏氣，在40 ℃下加熱10 min。電子鼻參數：以潔凈干燥空氣為載氣，氣體流量150 mL/s，平衡溫度40 ℃，數據采集時間200 s，延滯時間250 s。測試下一個樣品前，進行150 s的清潔程序，直到傳感器信號返回基線，每個樣品重復測定3 次。

表2 電子鼻化學傳感器及其主要響應的物質Table 2 Performance descriptions of electronic nose chemical sensors

1.3.5 菌落總數測定

參照GB 4789.2ü2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》的方法測定菌落總數。

1.3.6 加速貯藏實驗及保持期預測

參考雙實驗溫度法[27]，將3 組不同添加量PT的低溫火腿腸置于恒溫培養箱中。通常情況下，溫度每上升5 ℃，火腿腸的劣變現象會發生顯著性變化。因此，分別于32 ℃（T1）和37 ℃（T2）下進行貯藏。以處理當天為計時起點第0天，分別在37 ℃下第0、2、4、6、8、10、12、14天和32 ℃下第3、6、9、12、15、18天定期測定低溫火腿腸的各項指標。

根據ASLT模型，進行保質期預測。根據每組樣品在特定溫度下的保存時間，按式（1）計算溫度相差5 ℃時貨架壽命的比值（Q5）。

式中：T1為確定貨架期的已知溫度點；T2為所求貨架期的溫度點；f1、f2分別為在溫度T1、T2條件下的貨架期。

同時，在低于最高實驗溫度的任何溫度條件下，2 次測試的時間間隔按式（2）計算：

式中：t1為較低實驗溫度T1時每次測試之間的時間間隔/d；t2為最高實驗溫度T2時每次測試之間的時間間隔/d；ΔT＝T1-T2。

根據每個樣品在溫度相差5 ℃下的保存時間計算Q5，得到式（3）：

將T1＝37 ℃、T2＝4 ℃代入式（1）可得式（4），在低溫4 ℃條件下樣品的保質期按式（4）計算：

1.4 數據處理

實驗重復測定3 次，結果以平均值±標準差表示，采用Origin 2018軟件作圖。使用SPSS軟件進行顯著性分析和Pearson相關性分析，差異顯著性水平為P＜0.05，使用Winmuster軟件處理電子鼻分析數據。

2 結果與分析

2.1 低溫火腿腸的品質變化

2.1.1 不同PT添加量對低溫火腿腸感官評價的影響

在貯藏期間，影響肉制品感官品質的因素復雜，如蛋白水解、脂肪氧化、化學氧化等[28]。如圖1所示， 37 ℃和32 ℃貯藏初期，3 組低溫火腿腸感官評分差異不顯著（P＞0.05）。隨貯藏時間的延長，低溫火腿腸表面發黏，顏色變深，逐漸出現酸敗味等現象，導致嫩度變差，脂質氧化蛋白質水解，整體評分下降，其中對照組較為明顯，且在第8天時感官評分已不可接受（55.67f2.14）。37 ℃下貯藏第2、6、8天和32 ℃下貯藏第6、9、15天時，對照組的感官評分顯著低于PT組（P＜0.05）。與未貯藏時相比，在37、32 ℃貯藏最后1 d（貯藏14 d和18 d），對照組、0.02% PT組、0.10% PT組的感官評分分別降低57.00%、56.34%、52.63%和52.26%、49.53%、40.37%。以上結果表明，在貯藏后期，PT能延緩低溫火腿腸感官品質的下降。這與石長波等[29]在火腿腸中添加兒茶素大豆分離蛋白復合物后，貯藏期間感官評分大于對照組的結果一致。

圖1 不同多褐藻酚添加量對低溫火腿腸感官評分的影響Fig. 1 Effect of different PT supplementation levels on sensory score of low-temperature sausage

2.1.2 不同PT添加量對低溫火腿腸脂質氧化的影響

肉制品中含有豐富的脂肪，因而極易發生自由基鏈式反應（脂肪自動氧化），產生低級醛酮類物質。TBARs值可以反映肉制品氧化酸敗的程度，隨著脂肪氧化程度的增加，產生的TBARs混合物不斷增多，TBARs值隨之增大[30-31]。如圖2所示，隨著貯藏時間的延長，低溫火腿腸的TBARs值呈顯著上升趨勢（P＜0.05），且對照組的TBARs值增長速率顯著高于PT組（P＜0.05）。未貯藏時，3 組樣品的TBARs值差異不顯著。第6天開始，對照組的TBARs值顯著高于PT組（P＜0.05）。與貯藏末期對照組相比，在37 ℃和32 ℃貯藏最后1 d時，0.02% PT組和0.10% PT組的TBARs值分別降低13.02%、24.83%、19.36%和32.18%，說明PT能有效抑制火腿腸脂肪氧化，且抑制程度呈明顯的量效關系。其原因可能是PT分子中具有大量羥基，與自由基相互結合，并能與Cu2+、Fe3+、Al3+等對食品氧化具有催化作用的金屬離子形成穩定的絡合物，從而抑制和延緩低溫火腿腸氧化變質，使其保持更好的品質。這與Nicorescu等[32]在火腿腸中添加玫瑰果多酚后TBARs值增長的速率小于未添加組的結果一致。

圖2 不同PT添加量對低溫火腿腸TBARs值的影響Fig. 2 Effect of different PT supplementation levels on TBARs value of low-temperature sausage

2.1.3 不同PT添加量的低溫火腿腸的電子鼻分析

如圖3所示，3 組樣品W1W、W2W、W1S、W2S傳感器的響應值增加幅度較大，且W2W的響應值隨著貯藏時間的延長呈現上升趨勢，在第8天響應值陡然增加（P＜0.05），貯藏最后1 d時，對照組、0.02% PT組、0.10% PT組在貯藏溫度為37 ℃時W1W最大，分別為7.996 0、7.466 8、7.423 4，32 ℃時W1W最大值為8.212 9、7.409 9、7.383 7。W1W和W2W均可檢測出硫化物，說明3 組樣品在貯藏過程中產生了揮發性硫化物，但添加PT后硫化物減少。肉制品在貯藏過程中蛋白質會因受到微生物的作用而被水解產生H2S，例如大腸桿菌在有氧條件下能利用葡萄糖和6-磷酸葡萄糖作為底物，分解氨基酸產生H2S等揮發性含硫化合物[33]。相比于對照組，PT組W1S和W2S響應值降低，W1S和W2S傳感器可以檢測在貯藏過程中因脂肪氧化生成的小分子醇類、醛酮類化合物，說明添加PT后提高了低溫火腿腸中醇類、醛酮類化合物揮發性物質的含量，并隨著添加量的增加而增加，所得結果與TBARs值的變化情況吻合。

圖3 37 ℃和32 ℃下PT低溫火腿腸電子鼻雷達圖Fig. 3 Radar plots of electron nose response for low-temperature sausage stored at 37 or 32 ℃

2.1.4 不同PT添加量的低溫火腿腸主成分分析（principal component analysis，PCA）

PCA通過將測定樣品多個指標的維度和數據轉換成特征向量并進行線性分析使得到的數據直觀性和可視性增加，PCA散點圖以更簡潔明了的方式呈現出數據間的聯系性[34]。圖4A表示37 ℃下對照組、0.02% PT組、0.10% PT的低溫火腿腸在第0天時PCA散點圖。PC1的貢獻率為87.9%，PC2的貢獻率為9.8%，累計貢獻率為97.7%，表明2 個主成分基本可以代表樣品的主要信息特征。PT的添加對低溫火腿腸的揮發性氣味造成一定影響，但3 組樣品的數據點在PCA圖中的分布較為集中，氣味差別較小，說明在第0天火腿腸氣味沒有明顯變化，PCA中氣味相近。圖4B表示37 ℃下低溫火腿腸在第8天時的PCA散點圖。其中PC1貢獻率為59.7%，PC2貢獻率為25.9%，累計貢獻率為85.6%，表明2 個主成分基本可以代表樣品的主要信息特征。從分布區域看，PT組的數據點分布較為集中，且有重合部分，說明二者整體氣味輪廓相近，不能從氣味上較好地區分。對照組的數據點主要分布在右上區域，距離其他樣品較遠，說明PT組和對照組能夠明顯區分。圖4C表示37 ℃下低溫火腿腸在第14天時的PCA散點圖。其中PC1貢獻率為65.4%，PC2貢獻率為18.1%，累計總貢獻率為83.5%。從分布區域看，PT組數據點相距較近，二者與對照組相距較遠，3 組樣品數據點無重合區域，因此利用電子鼻對3 組樣品進行區分效果較好。綜上所述，3 個組分別聚類在PCA圖中不同位置，0.02% PT組和0.10% PT組在第0、8天的聚類有部分重疊，說明二者差異不顯著。圖4D、E分別為32 ℃下第6天和第18天的低溫火腿腸電子鼻氣味PCA圖。第6天時，0.02% PT組和0.10% PT組相距較近；第18天時，3 組樣品之間距離較遠。此外，第6、18天時3 組樣品無重疊區域，可以明顯區分。

圖4 不同PT添加量的低溫火腿腸電子鼻PCA分析Fig. 4 PCA plots of low-temperature sausage with different PT supplementation levels based on the electronic nose signals

2.1.5 不同PT添加量對低溫火腿腸菌落總數的影響

肉制品腐敗變質的主要因素是由于貯藏過程中微生物數量的變化，菌落總數是衡量食品腐敗變質的重要指標[28]。由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，低溫火腿腸的菌落總數呈顯著上升趨勢（P＜0.05），且貯藏溫度越高，菌落總數增長越快。貯藏初期，3 組樣品的菌落總數已有顯著差異（P＜0.05）。隨著PT添加量的增加，菌落總數增長速率顯著減小，而對照組菌落總數增長速率最快，且貯藏最后1 d，37、32 ℃下菌落總數分別為（8.23f0.01）、（7.12f0.02）（lg（CFU/g）），且32 ℃貯藏時菌落總數增長速率明顯低于37 ℃。根據GB 2726ü2016《食品安全國家標準 熟肉制品》[35]中菌落總數最高安全限量為5（lg（CFU/g）），對照組、0.02% PT組、0.10% PT組在37 ℃下的菌落總數分別于第8、10、12天超標，在32 ℃下的菌落總數分別于第12、15、18天超標。在貯藏過程中蛋白質、糖類和脂類逐漸降解為小分子物質，為部分微生物提供營養來源，從而促進微生物不斷繁殖。上述研究結果表明，PT具有較好的抑菌性，且PT的使用量與抑制微生物繁殖呈明顯的量效關系。PT的添加有利于延長低溫火腿腸的保質期。這與陳雨晴等[36]以石莼多酚為保鮮劑添加到豬肉丸中結果類似，多酚添加組延長了保質期，尤其是多酚添加量與保鮮效果呈明顯的量效關系。

圖5 不同PT添加量對低溫火腿腸菌落總數的影響Fig. 5 Effect of different PT supplementation levels on TVC of low-temperature sausage

2.2 不同PT添加量低溫火腿腸的保質期預測

2.2.1 不同溫度貯藏期間理化指標與感官評分的相關性分析

對不同PT添加量低溫火腿腸在不同溫度貯藏期間各理化指標與感官評分間進行Pearson相關性分析，Pearson相關系數絕對值越大，表明二者之間的相關性越高。由表3～5可知，低溫火腿腸的感官評分與TBARs值、菌落總數之間的Pearson相關系數均大于0.92，說明指標間相關性較好。在所有相關檢測指標中，菌落總數與感官評分之間的相關性較其他指標更高，具有極顯著負相關，在32、37 ℃條件下對照組、0.02% PT組和0.10% PT組的相關系數分別為0.980、0.946、0.984、0.959、0.985、0.984；因此，將菌落總數作為低溫火腿腸品質變化和保質期動力學預測模型的關鍵指標。

表3 對照組低溫火腿腸在不同溫度貯藏期間各指標間的Pearson相關系數Table 3 Pearson’s correlation coefficients between electronic nose sensor signals and quality indicators for low-temperature sausage in the control group during storage at different temperatures

表5 0.10%PT組低溫火腿腸在不同溫度貯藏期間各指標間的Pearson相關系數Table 5 Pearson’s correlation coefficients between electronic nose sensor signals and quality indicators for low-temperature sausage in the 0.10% PT group during storage at different temperatures

2.2.2 保質期預測

根據GB 2726ü2016中菌落總數最高安全限量5（lg（CFU/g））[35]，確定PT添加量為0%、0.02%、0.10%復合低溫火腿腸在37 ℃下的保質期分別為6、8、10 d，在32 ℃下的保質期分別為9、12、15 d。根據公式（4）可得到對照組、0.02% PT組、0.10% PT組低溫火腿腸在4 ℃下的保質期分別為87、116、145 d。其中，未添加多酚的低溫火腿腸保質期為87 d，較市面上低溫火腿產品最短的保質期（3 個月）還略短3 d，可能是由于未添加亞硝酸鹽等化學防腐劑，產品易變質。0.02% PT組和0.10% PT組與市場上大多數產品的保質期相近，PT的抑菌且延長保質期效果頗為顯著。

3 結 論

本研究將PT以0.02%和0.10%的質量分數添加到低溫火腿腸中，探究其在32、37 ℃貯藏期間的品質變化，利用菌落總數為劣變指標預測保質期。研究結果表明，TBARs值、菌落總數在樣品貯藏過程中均呈現增長趨勢，且0.10% PT組顯著高于對照組（P＜0.05）。由保質期預測實驗可知，對照組、0.02% PT組、0.10% PT組的保質期分別為87、116、145 d。且添加PT的低溫火腿腸已超過市場3 個月（90 d）的平均保質期水平。說明PT能夠以其優良的抗氧化、抑菌活性應用到肉制品中延緩脂質氧化、微生物生長，并在不降低品質的前提下延長產品保質期，保持低溫火腿腸的風味。同時，所有指標均表明0.10% PT組的低溫火腿腸品質優于0.02% PT組。在實際應用中需要根據產品品質要求進行添加量上的選擇，在最大程度上發揮PT的抗氧化和抑菌作用，從而使其在肉制品的生產中發揮顯著的效果。