順式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-環己烷二胺)合鉑(Ⅳ)的合成、表征及抗腫瘤活性

劉其星, 王應飛, 謝麗嬌, 叢艷偉, 曾 艷, 孫明能, 沈慶飛

(1. 昆明貴研藥業有限公司,云南 昆明 650106; 2. 云南師范大學 職業技術教育學院,云南 昆明 650500)

鉑類抗癌藥作為化療體系中的一大分支,對睪丸癌、卵巢癌、結腸直腸癌和非小細胞肺癌等實體腫瘤的治療效果,顯現出優于其它化學藥物的特性,對改善癌癥患者的生活質量及延長壽命起到了積極作用[1-4]。目前,已獲批準上市的鉑類抗癌藥包括順鉑、卡鉑、奈達鉑、奧沙利鉑、洛鉑、庚鉑和米鉑(圖 1)。值得注意的是,上述鉑類抗癌藥均為二價經典構型的鉑配合物,存在毒副作用大、耐藥性和劑量限制等缺陷。產生該缺陷的原因在于鉑類藥物屬于細胞毒類化合物,對癌細胞缺乏足夠的選擇性,在殺死癌細胞的同時,亦對正常細胞起到殺傷作用,導致受體表現出感覺異常、惡心、嘔吐、脫發和變態性發熱等癥狀,進而使藥物用量受限。此外,癌細胞先天或后天對鉑類藥物不敏感,是產生耐藥性的重要原因。

圖1 已批準上市的鉑類抗癌藥

為克服或彌補此類缺點,研究人員陸續開發了一系列新型鉑配合物藥物,如具有空間位阻的鉑配合物[5-7]、具有生物活性配體的鉑配合物[8-10]、單官能團鉑配合物[11-13]、具有反式幾何結構的鉑配合物[14-16]、多核鉑配合物[17-19]以及四價鉑配合物[20-22]等。其中,四價鉑配合物可在軸向位置引入新的配體,允許進一步的化學修飾和調整性質,且該類鉑配合物穩定性良好、可口服、不易與蛋白質發生反應、毒副作用小且可靶向給藥[23],成為近年來鉑類抗腫瘤藥物的研發熱點[24-25]。

研究表明[26-27],奧沙利鉑對癌細胞的作用機理不同于順鉑和卡鉑,它能夠引起核糖體生物及核仁發生應激,從而表現出不同的臨床應用和副作用。奧沙利鉑還可誘導免疫原性細胞凋亡,這與其治療高度相關[28];在缺乏TLR4基因片段的結直腸癌患者中,奧沙利鉑的抗癌效果較差[29]。因此,免疫系統的調節將影響奧沙利鉑的抗癌作用。

霉酚酸酯作為一種主要的免疫抑制劑,已被國內外廣泛用于預防和治療移植器官急性排斥反應[30-31]。鑒于霉酚酸具有優良的免疫系統調節能力,在對奧沙利鉑進行氧化制成四價鉑配合物時,對其軸向兩端分別引入霉酚酸,有望獲得新的鉑配合物,既能保存奧沙利鉑本身對大腸癌、卵巢癌和非小細胞肺癌等的較好療效,又能在治療過程中發揮霉酚酸具有的免疫抑制活性,使之成為一種潛在的鉑類抗癌新藥。

本文設計并合成了一種新型鉑(Ⅳ)配合物——順式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-環己烷二胺)合鉑(Ⅳ)(圖2),采用元素分析、質譜、紅外光譜和核磁共振表征了配合物的組成和化學結構,并采用溴化噻唑藍四氮唑(MTT)比色法對目標化合物進行抗腫瘤活性評價。

圖2 順式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-環己烷二胺合鉑(Ⅵ)的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司);AutoSpec 3000型質譜儀(美國Waters公司);Bruker Avance DRX 500型核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司);Vario EL Ⅲ型元素分析儀(德國Elementar公司);Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀(美國賽默飛世爾科技公司);Aeries型X-射線衍射儀(荷蘭帕納科公司)。

奧沙利鉑(純度≥99%,昆明貴研藥業有限公司);苯并三唑四甲基四氟硼酸(TBTU,吉爾生化(上海)有限公司);三乙胺,98%霉酚酸(阿拉丁試劑(上海)有限公司);30%過氧化氫,DMF,甲醇(天津市風船化學試劑科技有限公司);丙酮,乙醚,乙醇(云南楊林工業開發區汕滇藥業有限公司);純水(昆明貴研藥業有限公司自制),若無特殊說明,所有藥品皆為分析純。

1.2 順式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-環己烷二胺)合鉑(Ⅳ)的合成

向1000 mL圓底燒瓶中加入奧沙利鉑10.00 g(25.19 mmol)和純水800 mL,于70 ℃避光攪拌20 min;緩慢加入30%雙氧水15 mL,加畢,反應4 h。冰水浴冷卻1 h,過濾,固體物依次用純水洗滌3次,用乙醇洗滌1次,于80 ℃干燥至恒重得Ⅳ 9.51 g(22.06 mmol),收率87.60%。

取Ⅳ 5.00 g(11.60 mmol)、 DMF 300 mL,于60 ℃避光攪拌30 min至溶清;緩慢加入霉酚酸11.22 g(35.06 mmol)、三乙胺3.53 g(34.95 mmol)和TBTU 11.25 g(35.05 mmol),充分攪勻,反應72 h。濃縮,剩余物加入甲醇-丙酮混合液1000 mL(甲醇∶丙酮=1∶1,V∶V),充分攪拌,靜置、過濾,固體物用純水洗滌、濾干得粗產物。將全部粗產物移入100 mL乙醚溶劑中,于30 ℃攪拌10 min;過濾,濾液緩慢移入甲醇-丙酮混合液1000 mL(甲醇∶丙酮=1∶4,V∶V),過濾,固體物用純水洗滌、濾干,于80 ℃干燥至恒重得Ⅳ 4.31 g,收率35.90%(以奧沙利鉑計),含量96.58%;1H NMRδ: 9.37～9.36(s, 2H, 2OH of 2C17H19O6), 8.31～8.30(s, 2H, 2CH of 2C17H19O6), 5.24(s, 4H, 2CH2of 2C17H19O6), 5.13～5.11(t, 2H, 2CH of C6H14N2), 3.69(s, 6H, 2CH3of 2C17H19O6), 3.28～3.27(s, 4H, 2CH2of 2C17H19O6), 2.48～2.47(s, 4H, 2CH2of 2C17H19O6), 2.31～2.28(t, 4H, 2CH2of 2C17H19O6), 2.11～2.08(t, 6H, 2CH3of 2C17H19O6), 2.07(s, 4H, 2CH2of C6H14N2), 1.70(s, 6H, 2CH3of 2C17H19O6), 1.48～1.36(d, 4H, 2NH2of C6H14N2), 1.18～1.08(m, 4H, 2CH2of C6H14N2);13C NMRδ: 180.85(C-1″, 1?), 170.60(11″, 11?-COO), 163.87(C-1′, 2′), 163.01(C-8″, 8?), 153.14(C-12″, 12?), 146.29(C-10″, 10?), 134.35(C-4″, 4?), 123.06(C-5″, 5?), 122.87(C-7″, 7?), 116.46(C-9″, 9?), 107.46(C-11″, 11?), 69.08(10″, 10?-CH2O), 61.13(8″, 8?-OCH3), 46.23(C-3″, 3?), 40.49(C-2″, 2?), 35.50(C-1, 2), 31.38(C-3, 6), 23.95(C-4, 5), 22.87(C-6″, 6?), 16.43(4″, 4?-CH3), 11.53(9″, 9?-CH3); IRν: 3445(OH), 3189(NH2), 2925(CH3), 2870(CH2), 1600(C=C), 1376(COO), 1172(C—C), 1111(C—O—C), 720(Pt—N), 449(Pt—O)[32-33]; HR-MS(ESI)m/z: [C42H52N2O16Pt+Na]+=1058.2879(100%), 1059.2891(94.6%), 1057.2856(63.2%), 1060.2913(37.7%), 1061.2910(21.9%), 1062.2930(11.6%); Anal.calcd for C42H52N2O16Pt: C 48.70, H 5.06, N 2.70, Pt 18.83, found C 48.57, H 4.99, N 2.78, Pt 18.88。

1.3 體外抗癌活性測試

采用溴化噻唑藍四氮唑(MTT)比色法測試了Ⅳ對SW480人體結腸癌細胞株、HCT-116人體結直腸癌細胞株、A2780人體卵巢癌細胞株、A549人體非小細胞肺癌細胞株和U-2OS人體骨肉瘤細胞株的體外抗癌活性。

對所選用的細胞株均培養在含有10%胎牛血清的RPMI-1640生長培養基中,培養條件為飽和濕度、37 ℃、 5% CO2環境。取對數生長期的細胞于96孔細胞培養板中,調整細胞密度,使每孔約含有4000～6000個細胞。孔板中設加藥、對照(只加細胞不加藥物)和空白(只加無細胞培養液)3組,其中加藥組中以順鉑、賽特鉑為陽性對照,培養24 h貼壁。當測試時將完全培養基稀釋成所需濃度,DMSO終濃度不超過0.1%,每個濃度設5個復孔。加藥后(新型鉑配合物提前溶解于DMSO溶劑中)再將細胞放回原培養環境中繼續培養48 h,加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT孵育4 h,吸去液體,加入150 μL的DMSO溶劑,使甲瓚完全溶解。30 min內,用酶標儀在490 nm波長下測定OD值,并計算抑制率。試驗平行進行3次,根據抑制率采用非線性回歸方法計算半抑制率IC50值。

2 結果與討論

2.1 合成條件分析

本文以奧沙利鉑為起始物料,在雙氧水的氧化下,于奧沙利鉑軸向兩端成功引入羥基,制得中間體順式-草酸-二羥基-(反式-1,2-環己烷二胺)合鉑(Ⅳ)。再將此中間體于DMF中溶解,以霉酚酸為反應原料、三乙胺為催化劑、TBTU為偶聯劑,成功將霉酚酸引入奧沙利鉑軸向兩端,形成霉酚酸酯,制得目標化合物Ⅳ。

在前期研究中,發現第二步反應中使用的DMF與DMSO均有相似的溶解能力,進一步考察,發現在后續的濃縮環節時,DMSO本身具備的的高沸點及吸潮性增大了低壓濃縮除去DMSO的難度,因此,仍選用DMF溶劑。經過一段時間的反應,制得目標化合物母液,再根據不同溶劑的極性差異,順利地制備出具有較高含量目標化合物的樣品。

2.2 體外抗癌活性評價

根據制得的新型鉑配合物結構,以及該結構中含有的霉酚酸在骨肉瘤中潛在的應用前景[34],故選擇1株人體結腸癌細胞株(SW480)、 1株人體結直腸癌細胞株(HCT-116)、 1株人體卵巢癌細胞株(A2780)、 1株人體非小細胞肺癌細胞株(A549)和1株人體骨肉瘤細胞株(U-2OS)為細胞模型,采用MTT法來評價目標化合物的抗腫瘤細胞增值活性,根據抑制率計算半數抑制濃度IC50值,結果見表1。

表1 目標化合物的生物活性

從表1中可以看出,目標化合物對選定的SW480、 HCT-116、 A2780和U-2OS腫瘤細胞株的增殖均有良好的抑制活性,IC50均小于10 μmol/L,與奧沙利鉑接近。

本文設計、合成了一種新型鉑(Ⅳ)配合物—順式-草酸-二霉酚酸-(反式-1,2-環己烷二胺)合鉑(Ⅳ),并評價了其體外抗癌活性。結果顯示:目標化合物的效果與奧沙利鉑相當,且表現出良好的抑制人體骨肉瘤細胞U-2OS增殖的活性。