仿生石斛多糖對小鼠免疫器官的調節作用

李佳，鄭紫瑩，楊曉麗，白秭琳，田洋，白忠彬，3*

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南省藥食同源功能食品工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201）

石斛為蘭科植物中的第二大屬，包括鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、金釵石斛（Dendrobium nobile Lindl.）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxumLindl.）和流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum Hook.）的栽培品及其同屬植物的近似種，具有重要的藥用價值，是我國藥食同源的植物[1]。由于大部分石斛對生長環境的要求極為苛刻，其自然繁殖率極低，并且生長緩慢，因此野生石斛的產量較為稀少[2]。林下仿生石斛的培養條件最接近于野生石斛的生長環境，其植株富含多糖、生物堿、氨基酸、礦物質元素等功能性物質，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降血壓、降血糖等多種生理作用[3-4]。

多糖是由單糖組成的生物大分子之一，具有抗腫瘤[5]、免疫調節[6]、心血管調節[7]、胃腸道調節[8]、抗氧化[9]等作用。免疫應答是機體免疫系統對抗原異物刺激所產生的生理過程能維持機體的平衡穩態。研究表明，一些具有免疫調節作用的功能活性物質，可以增強機體的獲得性免疫、激活體內的免疫系統、提高對某些病毒和病菌的抵抗能力。因此，調節免疫活性已成為當下研究的熱點。近年來，有大量文獻研究表明，多種植物多糖具有免疫保護功能，如甘草多糖和艾葉多糖能夠明顯增強巨噬細胞內酶活性[10-11]；黑靈芝多糖能夠激活樹突狀細胞的活性[12]；蟬擬青霉多糖、牛膝多糖以及地黃多糖等可以促進細胞因子分泌[13]；板藍根多糖對淋巴細胞的增殖有促進作用[14]?？梢姡参锒嗵悄軌蛟鰪姍C體的免疫功能，是有效的免疫增強劑和免疫調節劑。研究發現，林下仿生石斛的生理活性、干物質成分等與大棚中種植的石斛具有明顯差異，其多糖成分所占比例也不同，由于林下仿生石斛中多糖組分含量較大，也預示著多糖類物質是林下仿生石斛發揮免疫調節作用的有效成分，具有重要的功能活性[15]。

本研究以環磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠為動物模型，探究林下仿生石斛莖多糖對免疫抑制小鼠的淋巴器官發育的影響，為后續林下仿生石斛資源的綜合利用以及開發具有免疫調節功效的功能性食品提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3年生林下仿生石斛：云南省普洱市斛哥莊園提供，為12月份采摘；SPF級C57BL/6J雄性6周齡小鼠40只，體重18 g～21 g：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養于云南農業大學工程中心動物飼養室，飼養環境溫度22℃～23℃，相對濕度60%～65%，自由飲水及進食。

IL-2（interleukin-2，IL-2）酶聯免疫試劑盒、IL-6（interleukin-6，IL-6）酶聯免疫試劑盒、IgM（immunoglobulin M，IgM）酶聯免疫試劑盒、IgG（immunoglobulin G，IgG）酶聯免疫試劑盒（96T）：江蘇酶免實業有限公司；硫酸：重慶川東化工有限公司；苯酚：阿拉丁試劑（上海）有限公司；無水乙醇：天津市風船化學試劑科技有限公司；正己烷、正丁醇、三氯甲烷：慶川東化工有限公司；無水葡萄糖：廣東光華科技股份有限公司；所有試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Epoch2波長酶標儀：美國伯騰儀器有限公司；RM2135石蠟切片機：德國LeiCa公司；FA1004N分析天平：上海精密科學儀器有限公司；IUV-5100紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；RE-3000A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SC-36低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機：上海比郎儀器制造有限公司；DHG-9030烘箱：上海申賢鼓風干燥箱；YKP-700 C電子顯微鏡：上海永科光學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 仿生石斛多糖的提取粗純化

林下仿生石斛多糖的提取主要參考本課題組前期優化的提取工藝[16]，稱取林下仿生石斛粉末25.00 g，加入125.0 mL正己烷攪拌2 d后過濾、除去濾液，加入相同體積的95%乙醇26℃下攪拌2 d后過濾，濾渣自然風干。經過脫脂處理后的仿生石斛濾渣按照料液比1∶60（g/mL），在 95℃沸水中浸提，共提取 3次，過濾取濾液，進行旋轉蒸發，濃縮至體積的1/5。

在濃縮后的多糖溶液中加入1/4體積的Sevage試劑（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1，體積比），混合振蕩30 min。3 500 r/min離心5 min，除去水層和有機溶劑層的變性蛋白，重復操作7次～8次，直到變性蛋白層消失。

將脫除蛋白質的多糖溶液以每袋25.0 mL～30.0 mL的體積裝入3 000 kD透析袋中，經反滲透水透析48 h，每隔3 h～4 h換1次水，然后將透析后的多糖溶液，以4倍體積95%乙醇的沉淀，4℃冰箱放置12 h，冷凍干燥后即得仿生石斛多糖（bionic dendrobium polysaccharide，BDP）。

1.3.2 仿生石斛多糖純度及提取率測定

通過苯酚-硫酸法測定仿生石斛多糖純度[17]，具體步驟如下。

精密吸取1.0 mg/mL葡萄糖標準品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL 于 10.0 mL 具塞試管中，補水至2.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，振蕩搖勻，加入5.0 mL濃硫酸，26℃放置10 min后30℃水浴20 min，在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度y為縱坐標，對照品溶液濃度x為橫坐標，繪制標準曲線。

準確量取仿生石斛多糖溶液1.0 mL于10.0 mL具塞試管中，加水至2.0 mL，按標準曲線的制備方法，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，振蕩搖勻，加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，26℃放置10 min后30℃水浴20 min，在490 nm波長處測定吸光度，通過標準曲線計算出供試品溶液中仿生石斛多糖濃度，仿生石斛多糖純度及提取率計算公式如下。

式中：C為標準曲線上讀出的多糖濃度，mg/mL；C母為樣品濃度，0.1mg/mL；F為稀釋倍數，100倍。

1.4 實驗動物的分組與處理

C57BL/6J雄性小鼠適應性喂養7 d后隨機分成4組，每組10只，分別為空白對照組（正常組）、免疫抑制模型組（模型組）、陽性對照組（左旋咪唑組）、仿生石斛多糖組。除空白對照組外，其余3組通過10 mg/mL的環磷酰胺溶液[母液為8.0 mL/（kg·d），溶于生理鹽水]腹腔注射，每日1次，連續7 d，以構建免疫抑制小鼠模型。

1.5 小鼠臟器系數及外周免疫器官的收集及分析

構建免疫抑制模型成功后，將小鼠分為陽性對照組，灌胃10 mg/mL的左旋咪唑溶液[母液為4.0 mL/（kg·d），溶于生理鹽水]，仿生石斛多糖組灌胃10 mg/mL仿生石斛多糖溶液[母液為12.0 mL/（kg·d），溶于生理鹽水，該劑量為本課題小組前期實驗探究最適濃度]，連續灌胃10 d，每日1次?？瞻讓φ战M、模型組給予等體積的生理鹽水[母液為13.3 mL/（kg·d）]，每天觀察小鼠的活動指數（包括小鼠進食量、飲水量、毛發色澤、糞便性狀，活動情況），每天記錄1次小鼠體重變化、每3 d記錄飲食飲水情況，同時更換小鼠墊料，保持飼養環境干燥整潔。末次給藥后小鼠禁食12 h，對小鼠體重進行稱量。頸椎脫臼處死后，取眼球外周血、小鼠胸腺、脾臟、腸系膜淋巴結、腹股溝淋巴結，用0.9%NaCl溶液清洗，吸水紙吸干表面水分稱濕重，計算腸系膜淋巴結和腹股溝淋巴結比重，以胸腺、脾臟的質量（g）與體重（g）的比值表示臟器系數。胸腺系數、脾臟系數、腸系膜淋巴結比重、腹股溝淋巴結比重的計算公式如下。

1.6 小鼠腸系膜淋巴結及腸道組織病理學形態分析

取出小鼠腸道及腸系膜淋巴結后在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）溶液中沖洗干凈，置于4%多聚甲醛液中，26℃固定1 d后，自來水沖洗4h～6h，進行濃度梯度酒精脫水，酒精濃度分別為45%、55%、65%、75%、85%、95%。將已融化的石蠟快速放置于包埋容器中，用鑷子將樣本小心放入包埋容器內，擺正位置，待蠟塊凝固后；在切片機上進行切片，厚度為3 μm。切片置于65℃的烘箱中烤片1 h，使用二甲苯進行脫蠟，浸入65℃的二甲苯中15 min，取出后采用乙醇梯度水化，分別為乙醇二甲苯1 min、無水乙醇、95%、85%、75%、65%的乙醇各 1 min；純水沖洗 1遍（約10 s），進行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin andeosin，HE）染色，中性樹膠封片，26℃放置2 h，65℃烤片至樹膠凝固（1h以上）。在電子顯微鏡下觀察其組織形態并采集圖片。

1.7 小鼠血清中細胞因子以及免疫球蛋白的含量檢測

末次給藥后禁食12 h，摘眼球取小鼠外周血，置于2.0 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，得各組小鼠血清樣品，參考ELISA試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中細胞因子IL-2、IL-6和免疫球蛋白IgG、IgM的水平。

1.8 數據處理

所有指標進行3次重復測定，采用Prism-Graph-Pad 6.0軟件進行數據統計分析，采用One-Turkey分析各組間顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 仿生石斛多糖純度及提取率的測定結果

圖1為葡萄糖標準曲線。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

由圖1可知，標準曲線回歸方程y=10.939x+0.042，R2=0.999 6，計算得到仿生石斛多糖樣品濃度，所得到的仿生石斛多糖純度為85.58%。試驗結果表明，25.00 g仿生石斛粉末可以提取1.70 g的凍干仿生石斛多糖粉，提取率為6.32%。

2.2 仿生石斛多糖對免疫抑制小鼠生理狀態的影響

在飼養小鼠的24 d內，每天對小鼠的體重進行稱量，每3 d對攝食、飲水情況進行統計，觀察小鼠的毛發光澤及糞便色澤。不同飼養時間對小鼠的體重、攝食量以及飲水量進行統計分析的結果如圖2所示。

圖2 小鼠的體重、攝食量以及飲水量的變化Fig.2 Changes in body weight，food intake，and water consumption of the mice

由圖2A可知，在環磷酰胺造模前，適應性喂養7 d內，小鼠的體重變化較為平穩，精神狀態良好，無任何疾病指征。在第7天開始造模，造模后第3天開始，小鼠的體重逐漸下降，毛發光澤度變暗黃，活動指數下降，糞便呈暗暗的淡黃色，糞便表面變得粗糙，顯示造模成功。由圖2B、圖2C可知，注射環磷酰胺后，模型組小鼠的攝食量與空白對照組相比明顯降低，這可能主要是由于小鼠的腸道受損，使得飲水量以及攝食量降低。通過灌胃仿生石斛粗多糖3 d后，仿生石斛多糖組小鼠的飲水量相較于模型組明顯提高158%，攝食量明顯提高了142%，體重也逐漸開始恢復。這表明仿生石斛多糖可以有效緩解由環磷酰胺導致的小鼠機體的不適癥狀。

2.3 仿生石斛多糖對免疫抑制脾臟和胸腺指數的影響

不同飼喂條件下，小鼠的脾臟及胸腺指數如圖3所示。

圖3 小鼠的脾臟及胸腺指數變化Fig.3 Spleen and thymus index changes of mice

脾臟和胸腺是動物體內的主要免疫器官[18]，胸腺是機體T細胞產生的器官，對機體的細胞和體液免疫均具有重要影響。脾臟中含有豐富的淋巴細胞和巨噬細胞，與機體的非特異性免疫密切相關[19-20]。脾臟和胸腺系數的高低能夠在一定程度上反映機體的非特異性免疫能力。因此對小鼠的脾臟、胸腺進行統計分析。由圖3可知，實驗小鼠注射環磷酰胺后，模型組小鼠相較空白對照組而言，脾臟指數高度顯著降低（P＜0.001），胸腺指數極顯著降低（P＜0.01），可見環磷酰胺使小鼠的免疫功能受到明顯抑制，預示免疫抑制模型造模成功。介入仿生石斛多糖后，仿生石斛多糖組的脾臟指數為模型組的1.55倍，脾臟指數高度顯著增加（P＜0.001）；胸腺指數極顯著增加（P＜0.01），為模型組的2.01倍。結果表明，仿生石斛多糖可以促進小鼠淋巴器官的發育，對免疫抑制小鼠具有正向免疫調節作用。

2.4 仿生石斛多糖對免疫抑制小鼠腹股溝淋巴結的影響

不同飼喂條件下，小鼠的外周免疫器官腹股溝淋巴結的變化見圖4、圖5。

圖4 小鼠的腹股溝淋巴結的表觀圖Fig.4 Apparent view of inguinal lymph nodes in mice

圖5 各實驗組小鼠的腹股溝淋巴結比重Fig.5 Proportion of inguinal lymph nodes in each experimental group

淋巴結是體內重要的外周免疫器官，它調節體液平衡，且參與免疫細胞運輸，可以調節免疫應答[21]。腹股溝淋巴結主要收集下肢、會陰、外生殖器、臀部和腹前壁臍以下區域的免疫信息，并作出相應的免疫應答。由圖4可知，實驗小鼠注射環磷酰胺后，模型組小鼠的腹股溝淋巴結幾乎看不到，這主要是由于環磷酰胺對于小鼠的周身免疫有一定的抑制作用，導致淋巴結變小，表明免疫抑制模型造模成功。介入仿生石斛多糖后，小鼠外周免疫器官腹股溝淋巴結得到恢復，在解剖過程中可以明顯觀察到淋巴結的存在，表明仿生石斛多糖可以有效提高小鼠的外周免疫能力。由圖5可知，通過稱取腹股溝淋巴結的濕重，仿生石斛多糖組的腹股溝淋巴結的比重為模型組的2.71倍，與模型組相比高度顯著增強（P＜0.001），結果表明，仿生石斛多糖可以促進小鼠淋巴器官的發育，對免疫抑制小鼠的周身免疫有正向調節作用。

2.5 仿生石斛多糖對免疫抑制小鼠腸道及其腸系膜淋巴結的影響

不同實驗條件下，各實驗組小鼠的空腸腸道組織病理學變化見圖6，腸系膜淋巴結組織病理學變化見圖7。

圖6 小鼠空腸組織病理學分析、絨毛長度與隱窩深度的比值及腸黏膜厚度變化Fig.6 Histopathological analysis of jejunum，ratio of villi length to crypt depth，and changes in intestinal mucosal thickness of mice

圖7 小鼠空腸腸系膜淋巴結病理學分析及比重變化Fig.7 Histopathological analysis of mesenteric lymph nodes in the jejunum and changes in specific gravity of mice

隱窩為腸壁的凹陷，絨毛為腸壁的凸起，隱窩深度增加會減弱營養物質的吸收能力，絨毛高度增加會提高營養物質的吸收能力[22]，因此，絨毛高度與隱窩深度比值越大，腸道吸收能力越強。處死小鼠后，對腸道黏膜層厚度、絨毛高度與隱窩深度比值、腸系膜淋巴結病理學及比重進行統計分析。由圖6A可知，空白對照組小鼠腸道絨毛排列整齊、緊密，模型組小鼠腸道絨毛變短，還發生碎裂。通過灌胃仿生石斛多糖后，小鼠的絨毛變得整齊致密，逐漸恢復至空白對照組水平。由圖6B可知，仿生石斛多糖組其絨毛高度與隱窩深度比值高度顯著大于模型組（P＜0.001），是模型組的1.64倍。由圖6C可知，仿生石斛多糖組腸道黏膜層厚度大于模型組，為模型組的1.62倍，差異極顯著（P＜0.01）。

腸道中存在多種淋巴組織，其中包含派氏集合淋巴結（peyerpatch，PP）結和腸系膜淋巴結。PP結是腸黏膜免疫系統的重要組成部分，是小腸壁黏膜內的一組淋巴濾泡，是T細胞和B細胞發生免疫應答的主要場所之一[23]。腸系膜淋巴結位于腸道系膜內，是腸道免疫細胞聚集和免疫應答的發生場所，腸系膜淋巴結可以直接反映腸道免疫調節的能力[24]。由圖7A可知，空白對照組小鼠淋巴結組織結構完整，淋巴濾泡發育完全，細胞排列緊密有序。與空白對照組相比，環磷酰胺使腸系膜淋巴結的長度縮短，淋巴結組織結構破損，皮質區和髓質區及淋巴濾泡分區不明顯，沒有清晰的淋巴濾泡，不能很好區分淋巴細胞的分布，細胞排列渙散，淋巴細胞數量少。通過對圖7B分析可知，介入仿生石斛多糖后，小鼠腸系膜淋巴結比重與模型組相比顯著增加，也改善了腸系膜淋巴結組織的發育狀況，計算可知仿生石斛組腸系膜淋巴結比重為模型組的1.55倍，長度為1.67倍，相較于模型組，差異高度顯著（P＜0.001）。表明仿生石斛多糖對小鼠的腸道免疫功能具有一定的調節作用，能夠在一定程度上改善由環磷酰胺誘導的免疫抑制性小鼠腸系膜淋巴結的組織損傷。

2.6 仿生石斛多糖對免疫抑制小鼠血清中分泌細胞因子水平的影響

不同實驗條件下，各實驗組小鼠細胞因子分泌情況如圖8所示。

圖8 小鼠血清中IL-2、IL-6的分泌水平變化Fig.8 Changes in the secretion levels of IL-2 and IL-6 in mice

細胞因子是調節免疫反應的重要靶點，白細胞介素2（IL-2）主要由活化的Th1細胞產生，對T細胞的增殖以及效應細胞和記憶細胞的產生有重要作用，有助于細胞免疫應答的產生[25]。白細胞介素6（IL-6）是一種用于維持體內平衡的細胞因子，通過激活Th2細胞來激活免疫應答，具有激活體液免疫的功能[26]。由圖8A可知，建模后小鼠血清中的細胞因子IL-2的分泌水平與空白對照組相比高度顯著降低（P＜0.001），介入仿生石斛多糖后，血清中的細胞因子IL-2開始增加，其中仿生石斛多糖組IL-2水平為模型組的1.47倍，這表明仿生石斛多糖可以刺激血清中細胞因子IL-2的分泌來調節小鼠的免疫，由圖8B可知，腹腔注射環磷酰胺后，血清中的IL-6分泌水平相較于空白對照組高度顯著降低（P＜0.001），仿生石斛多糖可以明顯提高小鼠血清中IL-6的分泌水平，其水平為模型組的1.76倍，與模型組有極顯著差異（P＜0.01）。說明仿生石斛多糖有助于恢復小鼠血清中IL-2、IL-6水平，且與陽性對照藥物左旋咪唑效果相當。表明仿生石斛多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的恢復具有積極作用。

2.7 仿生石斛多糖對免疫抑制小鼠血清中分泌免疫球蛋白水平的影響

不同飼喂實驗條件下，各實驗組小鼠血清中免疫球蛋白的分泌水平情況如圖9所示。

圖9 小鼠血清中IgM和IgG的分泌水平Fig.9 Changes in the secretion levels of IgM and IgG in mice

免疫球蛋白具有免疫調節的作用，是機體發生體液免疫功能的重要組成部分，在調節免疫方面起到重要作用[27]。疫苗或外源性抗原刺激機體多產生IgG屬性免疫球蛋白，IgM是機體內的保護性抗體，其濃度可作為機體感染的早期診斷[28]。通過檢測血清中IgG及IgM含量情況，可以查看小鼠免疫機能的恢復狀況。由圖9可知，與模型組對比，給予仿生石斛多糖后，血清中IgG顯著上調（P＜0.05），血清中IgM含量極顯著上調（P＜0.01）。其中，仿生石斛多糖組IgG水平為模型組1.52倍，IgM含量為模型組1.45倍。表明仿生石斛多糖對于血清中免疫球蛋白水平的調節具有積極的作用，仿生石斛多糖對免疫抑制小鼠機體免疫機能的恢復具有積極作用。

3 結論

研究表明林下仿生石斛多糖可明顯增強由環磷酰胺所導致的免疫抑制小鼠的免疫調節功能。明確了林下仿生石斛中的多糖可以顯著提高血清中免疫球蛋白水平（P＜0.05），調節血清中細胞因子IL-2和IL-6的分泌水平以促進機體淋巴細胞增殖，刺激B細胞產生抗體，來激活機體非特異應免疫應答，提高機體免疫功能。通過測量腸道黏膜層厚度、絨毛高度與隱窩深度比值、腸系膜淋巴結比重，以及對腸道免疫系統的病理學形態進行觀察，探討了仿生石斛多糖對腸道免疫功能的正向調節功能，為后續腸道黏膜免疫的研究奠定了基礎。但是機體免疫系統是一個極其復雜的系統，目前針對仿生石斛各組分獨立的免疫調節機制以及各組分之間的相互影響作用仍有待深入研究。