青錢柳紅米復合酒生產工藝優化及成分分析

李秀萍，張葦莉，劉琨毅，黎粵悅，吳決連，李楠*

（1.宜賓職業技術學院 五糧液技術與食品工程學院，四川 宜賓 644003；2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；3.廣西益譜檢測技術有限公司，廣西 南寧 530007）

青錢柳（Cyclocarya paliurus），因其果實長得如同一串串的銅錢，所以又稱為金錢柳。青錢柳含有植物多糖、黃酮、多酚、萜類、皂苷等多種活性物質，因此青錢柳能明顯降低機體膽固醇、甘油三酯，可用于糖尿病、高血壓、高血脂等疾病的預防和治療[1-3]。青錢柳多糖具抗癌[4]和抗氧化[5]的作用。巴拉吉紅米為主要生長于貴州黔東南高山梯田上的一種紅米，其含花色苷，故其顏色紅如瑪瑙。巴拉吉紅米營養價值極高，含有多酚、維生素、黃酮、γ-氨基丁酸等活性物質[6-7]，且富含硒、鋅、鐵等微量元素[8]，所以具有抗氧化[9]、改善腦血流通[10]、預防癌癥[11]等功效。由此可見，青錢柳和巴拉吉紅米均具有較高的應用價值。

目前，對于青錢柳的研究主要為多糖[12-13]和黃酮[14-15]的提取與功效[16-17]，還有少量以青錢柳為原輔料進行發酵食品的研究，如趙立春等[18-19]研制的青錢柳無糖茶凍和青錢柳雜糧代餐粉；魯青等[20]研究的青錢柳-葛根復合發酵型飲料；黃元河等[21]研究的青錢柳速溶茶等。然而，以青錢柳為原輔料釀酒，以及青錢柳經發酵成為發酵食品后對其進行成分分析的報道較少。本研究以巴拉吉紅米為主料，配以青錢柳為輔料，經過浸漬、蒸煮，再添加微生物復合菌種發酵得到青錢柳紅米復合酒，并初步探討發酵生產工藝，分析復合酒的成分，從而證明利用青錢柳復合紅米可以制備富含營養成分的發酵型復合酒，以期為青錢柳的開發利用及青錢柳發酵食品的成分分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴拉吉紅米、青錢柳樣品：貴州雷山縣瑞康生態農業投資有限公司；微生物復合菌種：廣西大學生命科學與技術學院實驗室自主研發，主要由根霉、米曲霉和酵母組成。

γ-氨基丁酸（分析純）：美國SIGMA公司；葡萄糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；蘆丁（分析純）：生物工程上海有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；苯酚、硫酸、硝酸鋁、無水乙醇、四硼酸鈉、次氯酸鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫鼓風干燥箱（101-2-BS-Ⅱ）：上海躍進醫療器械有限公司；酒精計：廣州市銘睿電子科技有限公司；分析天平（PL303）：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；雷磁pH計（PSH-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司；生化培養箱（LRH-250A）：上海精宏實驗設備有限公司；恒溫水浴鍋（TW-12）：重慶雅馬拓科技有限公司；分光光度計（uv1800）：日本株式會社島津制作所。

1.3 試驗方法

1.3.1 青錢柳紅米復合酒生產工藝流程

青錢柳加水煮沸→制備青錢柳浸提液→浸提液浸泡紅米→米飯蒸煮→冷卻→接種→發酵→過濾→青錢柳紅米復合酒

1.3.2 青錢柳紅米復合酒生產工藝操作要點

青錢柳浸提液的制備：青錢柳葉與水料液比1∶1.5（g/mL），100℃下加熱 20 min，過濾，制成青錢柳浸提液備用。

浸泡紅米：利用制備的青錢柳浸提液浸泡紅米12 h。

米飯蒸煮：浸泡的紅米隔水蒸30 min，要求米粒完整、熟而不糊、透而不爛、疏松均勻。

冷卻：蒸煮成熟的紅米飯，攤開冷卻，攤涼至30℃左右。

接種：按試驗要求的接種量，稱取微生物復合菌種，均勻撒于攤涼的米飯上，攪拌，使飯粒和菌種完全混勻。

發酵：將拌好的紅米飯移入三角瓶中，壓實不留縫隙，保鮮膜封口，橡皮筋包扎，置于生化培養箱中，28℃發酵至酒精度穩定。

過濾：用小型空壓過濾機進行膜過濾，制得青錢柳紅米復合酒。

1.3.3 單因素試驗

以酒精度為指標，考察青錢柳紅米復合酒發酵工藝中的紅米與青錢柳浸漬液料液比[1 ∶0、1 ∶0.5、1 ∶1.0、1∶1.5、1 ∶2.0（g/mL）]、微生物復合菌種接種量（0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%）、發酵溫度（26、28、30、32、34 ℃）和發酵時間（4、6、8、10、12 d）對酒精度的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以微生物復合菌種接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、紅米與青錢柳浸漬液的料液比（D）進行L16（44）的正交試驗，分別測定酒精度確定青錢柳紅米復合酒的最佳發酵條件。正交試驗設計見表1。

表1 正交試驗設計Table 1 Design of orthogonal test

1.3.5 理化指標測定

酒精度參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中的第二法測定，再換算成20℃時樣品的酒精度；還原糖采用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid method，DNS）法[22]測定；總酸參照GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》中的方法進行測定；總酯采用酸堿滴定法[23]測定。

1.3.6 成分測定

植物多糖采用苯酚-硫酸法[24]測定；黃酮采用紫外分光光度法[25]測定；總酚采用福林-酚法[26]測定；γ-氨基丁酸參照文獻[27]測定；氨基酸參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》，采用氨基酸分析儀測定；微量元素參照GB 5009.268—2016《食品安全國家標準食品中多元素的測定》，采用電感耦合等離子體質譜（inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS）法測定。

1.3.7 安全性指標檢測

菌落總數的測定參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》；大腸桿菌數參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》測定；鉛、無機砷、鎘、錫參照NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》中要求的GB 5009系列方法，采用ICP-MS法測定。黃曲霉毒素B1參照GB 5009.22—2016《食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》中的酶聯免疫法測定。

1.4 數據處理

試驗結果采用平均值±標準差表示，應用Microsoft Office Excel 2019和origin 8.5軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 紅米與青錢柳浸漬液料液比對酒精度的影響

紅米與青錢柳浸漬液料液比對酒精度的影響見圖1。

圖1 紅米與青錢柳浸漬液料液比對酒精度的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio of red rice to C.paliurus extract on alcohol content

由圖1可知，隨著紅米與青錢柳浸漬液料液比的增加，青錢柳紅米復合酒酒精度先增加后減少，當紅米與青錢柳浸漬液的料液比為1∶1.0時，酒精度最高，為16.3%vol。當紅米與青錢柳浸漬液料液比低于1∶1.0時，隨著青錢柳浸提液添加量的增加，浸泡和蒸煮時紅米的含水量增大，紅米中的淀粉水解和糖化增強，并且該作用在紅米與青錢柳浸漬液料液比為1∶1.0時達到最大；但當紅米與青錢柳浸漬液料液比超過1∶1.0時，酒精度又明顯下降，這可能是高濃度青錢柳中的黃酮對混合微生物菌株中某種菌株生長具有抑制作用，與相關報道[28]一致，青錢柳黃酮含量達到一定濃度時可以抑制霉菌或細菌的生長。

2.1.2 微生物復合菌種接種量對酒精度的影響

不同微生物復合菌種接種量對酒精度的影響見圖2。

圖2 微生物復合菌種接種量對酒精度的影響Fig.2 Effect of inoculation amount of microbial strains on alcohol content

由圖2可知，青錢柳紅米復合酒的酒精度隨著微生物復合菌種接種量的增加，呈先上升后趨于平穩的趨勢，當微生物復合菌種接種量（體積分數）為1.2%時，酒精度最高，達到15.8%vol。隨著微生物復合菌種接種量的增加，混合菌株中相應的霉菌和酵母菌數量均有所增加，微生物對淀粉的水解和糖化作用增強，從而有更多的底物被酵母菌發酵轉化為酒精，使酒精度增加。但是微生物復合菌種接種量超過1.2%時，發酵液中的微生物濃度過高，需要消耗更多的底物用于維持菌種生長，造成可用于酒精發酵的底物反而減少，從而導致酒精的生成量減少。

2.1.3 發酵溫度對酒精度的影響

不同發酵溫度對酒精度的影響見圖3。

圖3 發酵溫度對酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content

由圖3可知，隨著發酵溫度的升高，青錢柳紅米復合酒中酒精度呈先上升后下降的趨勢。發酵溫度為30℃時酒精度最高，為16.5%vol。當發酵溫度較低時，微生物復合菌種中的霉菌和酵母菌不僅生長受到抑制，而且用于淀粉水解、糖化和酒精發酵的酶的活性也減弱，使得底物轉化效率不高，導致糖化作用和酒精發酵進行得緩慢，酒精得率低；當發酵溫度適宜時，微生物生長、發酵旺盛，酒精度高。當發酵溫度過高，微生物菌株的生長受到抑制甚至死亡，從而導致酒精產量下降。

2.1.4 發酵時間對發酵的影響

不同發酵時間對酒精度的影響見圖4。

圖4 發酵時間對酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，青錢柳紅米復合酒的酒精度呈先上升后趨于平穩的趨勢。發酵到第10天時，酒精度最高，為15.6%vol。發酵時間過短，混合微生物菌株濃度不高，有很多底物未被轉化完全，致使底物轉化率低，從而酒精得率低；當發酵時間超過10 d后，隨著發酵時間的繼續延長，酒精度不再增加而趨于平穩，結果說明隨著發酵時間的延長，培養基中用于酒精發酵的原料物質耗盡而影響酒精的增加。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，采用L16（44）正交試驗確定青錢柳紅米復合酒發酵的最佳工藝參數，結果如表2所示。對表2中數據進行方差分析，結果如表3所示。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

表3 正交試驗方差分析Table 3 Orthogonal test analysis of variance

由表2和3可知，影響青錢柳紅米復合酒發酵的主次因素為C（發酵時間）＞B（發酵溫度）＞A（微生物復合菌種接種量）＞D（紅米與青錢柳浸漬液料液比），其中發酵時間和發酵溫度對青錢柳紅米復合酒酒精度有顯著影響（P＜0.05）；最佳的工藝組合為 A2B3C2D3，即微生物復合菌種接種量0.8%、發酵溫度30℃、發酵時間10 d、紅米與青錢柳浸漬液料液比為1∶1.0（g/mL）。為了驗證正交試驗結果的可靠性，按照最優組合，進行3次平行驗證試驗，得到的青錢柳紅米復合酒的平均酒精度為16.3%vol，與正交試驗中最高的第5組結果相近（相對偏差0.613%），說明正交試驗的可靠性。

2.3 青錢柳紅米復合酒成分分析

2.3.1 理化指標與微量元素分析

對青錢柳紅米復合酒理化指標和微量元素進行分析可知，青錢柳紅米復合酒的酒精度為16.3%vol、還原糖為9.1 g/L、總酸為6.1 g/L、總酯為0.71 g/L。此外，青錢柳紅米復合酒中含有鐵、銅、鋅、錳和硒微量元素，尤其是青錢柳紅米復合酒還含有0.039 mg/kg的硒元素，可認為該復合酒為含硒食品。

2.3.2 安全性指標

復合酒安全性指標見表4。

表4 復合酒安全性指標Table 4 Security indexes of compound wine

由表4可知，青錢柳紅米復合酒菌落總數和大腸桿菌數均未檢出，微生物符合NY/T 1885—2017《綠色食品米酒》標準的要求；有毒有害物質中，錫未檢出，黃曲霉毒素B1未檢出，鉛≤0.3 mg/kg，無機砷≤0.15 mg/kg，鎘≤0.2 mg/kg，有毒有害物質未超標。以上結果說明，青錢柳紅米復合酒是一種安全的發酵食品。

2.3.3 活性成分分析

活性成分分別以植物多糖、黃酮、總酚和γ-氨基丁酸作為測定指標，利用單純紅米發酵酒和青錢柳紅米復合酒進行比對試驗，結果見表5。

表5 復合酒活性成分分析Table 5 Functional component analysis of compound wine mg/100 g

由表5可知，添加青錢柳可以使紅米酒中4種活性成分的含量均增加，其中植物多糖含量達到573.2 mg/100g，比紅米酒增加6倍多；黃酮含量為196.3mg/100 g，增幅達到1.7倍；總酚含量為201.2 mg/100 g，比未添加青錢柳的紅米酒增加近1倍；相對于紅米酒，青錢柳紅米復合酒中γ-氨基丁酸略有增加。通過試驗證明利用青錢柳紅米復合發酵可以生產富含活性成分的復合酒。

2.3.4 氨基酸成分分析

復合酒氨基酸成分分析見表6。

表6 復合酒氨基酸成分分析Table 6 Amino acid composition analysis of compound wine

由表6可知，紅米酒和青錢柳紅米復合酒中均含16種氨基酸，其中必需氨基酸均為5種，氨基酸總含量分別為3 871.6 mg/L、7 976.4 mg/L，由此可見添加青錢柳后，青錢柳紅米復合酒中的總氨基酸得到了成倍增加，提高了青錢柳紅米復合酒的營養價值。根據蔣瀅等[29]的報道，不同的氨基酸呈現不同的味覺，可將氨基酸分為甜味、苦味、酸味、鮮味氨基酸，本研究中添加青錢柳后，青錢柳紅米復合酒中的每種氨基酸含量均高于紅米酒，因此添加青錢柳會使青錢柳紅米復合酒的甜味、苦味、酸味、鮮味得到提升，使青錢柳紅米復合酒的口感更加豐富。

3 結論

本研究通過制備青錢柳浸提液，巴拉吉紅米浸泡、蒸煮，再添加微生物復合菌種進行發酵，以微生物復合菌種接種量、發酵溫度、發酵時間、紅米與青錢柳浸漬液料液比為考察對象進行單因素和正交試驗，測定發酵液酒精度，確定了青錢柳紅米復合酒發酵的最佳工藝為紅米與青錢柳浸漬液料液比為1∶1.0（g/mL）、微生物復合菌種接種量0.8%、發酵溫度30℃、發酵時間10 d。在最優條件下，得到的青錢柳紅米復合酒的酒精度為16.3%vol、還原糖為9.1 g/L、總酸為6.1 g/L、總酯為0.71 g/L，含有鐵、銅、鋅、錳和硒等微量元素。經過安全性指標分析表明，該青錢柳紅米復合酒中的微生物符合要求，有毒有害物質未超標。成分分析表明，青錢柳紅米復合酒含植物多糖573.2 mg/100 g、黃酮196.3mg/100g、總酚 201.2mg/100g、γ-氨基丁酸 24.2mg/100 g；含有16種氨基酸，其中5種為必需氨基酸，氨基酸總含量為7 976.4 mg/L；此外還含有0.039 mg/kg的硒元素。通過試驗證明，青錢柳復合紅米發酵生產的青錢柳紅米復合酒是一種富含營養成分的發酵食品。此外，本研究發現青錢柳紅米復合酒含有黃酮、多酚，今后可對其抗氧化功能進行研究。