建立DARQ-LAMP方法快速檢測單增李斯特菌

韋錦源，劉丹，楊靜賢，李孜，鐘青萍

（廣東省食品質量與安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642）

食源性疾病是一類通過攝取食物使致病因子進入體內(nèi)而引起感染或中毒的常見人類疾病[1-2]，其在全球范圍內(nèi)造成嚴重的公共衛(wèi)生負擔，對經(jīng)濟及社會發(fā)展均造成了不利影響[3-4]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2020年數(shù)據(jù)顯示，全世界每年有5.5億人因食用受污染的食物而患病，其中約23萬人死亡[5]。食源性致病菌是引起食源性疾病的一大原因[6-7]，其中單增李斯特氏菌是常見致病菌，它廣泛存在于環(huán)境、食品、人和動物宿主中，可以在極端條件下生存并引起食物污染，食用被該菌污染的食物會引起李斯特菌病，致死率高達20%～30%，對公共衛(wèi)生安全危害較大[8-9]。對于常見致病菌的檢測，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法仍是公認且可靠的方法，但需要經(jīng)過細菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學觀察、生化鑒定等多個步驟，較為繁瑣[10-12]；常規(guī)聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法因檢測時間較長而受限。基于免疫學技術的檢測不能區(qū)分死活細胞[13]。

環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是由 Notomi等[14]于 2000 年提出的一種核酸擴增技術，可在恒溫的條件下對靶基因進行檢測[15-16]，但是常規(guī)的LAMP方法需要擴增完成后進行染色，容易形成氣溶膠污染[17]；依靠對反應過程或終點進行熒光染色的熒光環(huán)介導等溫擴增（real-time loopmediated isothermal amplification，real-time LAMP）可較好地解決此問題[18]，但熒光染料染色易造成假陽性，因此尋求一種更精準、便捷的染色方法顯得至關重要。基于淬滅基團釋放環(huán)介導等溫擴增技術（detection of amplification by release of quenching-LAMP，DARQLAMP）是在一條內(nèi)引物的5’端修飾熒光基團（或淬滅基團），并加入一條與上游內(nèi)引物（forward inner primer，F(xiàn)IP）中的F1c部分互補且3’端修飾淬滅基團（或熒光基團）的探針，該探針在反應前需預先與內(nèi)引物進行孵育，使探針與內(nèi)引物雜交形成淬滅探針雙鏈（quenching probe double chain，QPD），使得熒光處于淬滅狀態(tài)，當聚合酶遇到雙鏈，探針就會移位并產(chǎn)生熒光信號[19]。DARQ-LAMP方法具有靈敏度高、特異性強、快速的特點，但未有檢測單增李斯特菌的研究報道[20-22]。本文針對單增李斯特氏菌的特異性基因hlyA設計引物[23]，優(yōu)化反應條件，建立real-time LAMP方法，并在此基礎上進一步建立DARQ-LAMP方法，提高檢測效率，為LAMP檢測食源性致病菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

目標菌株：單增李斯特菌（Listeria monocytogenes ATCC 19115），以及非目標菌株：斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri ATCC 35967）、英諾克李斯特菌（Listeria innocua ATCC 33090）、伊氏利斯特菌（Listeria ivanovii ATCC19119）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 25922）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri ATCC 12022）、屎腸球菌（Enterococcus faecium ATCC 29212）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis CGMCC 26069）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes ATCC 13048）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis CGMCC 1.1869）、馬紅球菌（Rhodococcus equi ATCC 6939），均于華南農(nóng)業(yè)大學食品質量與安全實驗室保藏。

柱式細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518255）、溶菌酶、Bst DNA 聚合酶、Taq PCR Master Mix、Bst LF DNA Polymerase、10×ThermoPol緩沖液、MgCl2溶液、dNTP Mixture、滅菌雙蒸水：中國上海生工（生物工程）股份有限公司；Eve Green（20×水溶液）：中國翌圣生物科技（上海）有限公司；胰蛋白胨、Baird-Parker瓊脂基礎、PALCAM瓊脂粉、腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基、大豆蛋白胨：中國廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FormaClassⅡ生物安全柜：美國Thermo公司；THZ-100恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學儀器有限公司；CFX 96TM熒光定量PCR儀：伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；SP-02生化培養(yǎng)箱：廣州市綠向生物科技有限公司；VORTEX-3渦旋振蕩器：上海金鵬分析儀器有限公司；TP600梯度PCR儀：日本Ta-KaRa儀器有限公司；NanoDrop 2000c超微量分光光度計、5417R高速冷凍離心機：美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；AF100制冰機：意大利SCOTSMAN公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

保藏于-80℃的單增李斯特菌在腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基中，150 r/min活化16 h備用，其余菌株于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中37℃、150 r/min活化16 h。

1.3.2 DNA模板的制備

采用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取模板DNA，具體步驟按照柱式細菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518255）說明書進行。

1.3.3 LAMP引物和探針的設計與合成

從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得單增李斯特菌（GenBank：HM589597.1）的基因序列，基于序列信息和相關前期研究，使用LAMP引物設計工具Primer Explorer V5（https：//primerexplorer.jp/e/）針對特異性基因hlyA進行引物設計。最終確定的引物和探針由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。熒光基團為FAM、淬滅基團為BHQ-1、熒光最大激發(fā)波長為494 nm、熒光最大發(fā)射波長為518 nm、淬滅劑的淬滅范圍為480 nm～580 nm。

表1 LAMP引物和探針序列Table 1 LAMP primers and probe sequences

1.3.4 以hlyA為靶基因建立檢測單增李斯特菌的real-time LAMP

以單增李斯特菌標準菌株進行real-time LAMP反應，以非目標菌株做陰性對照。優(yōu)化前的real-timeLAMP反應體系（25 μL）包括：F3 與 B3 各 0.2 μmol/L，F(xiàn)IP 與下游內(nèi)引物（backward inner primer，BIP）各 1.6 μmol/L，脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTPs）1.6 mmol/L，Mg2+6 mmol/L，Bst DNA 聚合酶 8 U，10×Reation Buffer 2.5 μL，20×EvaGreen 水溶液 1 μL，DNA模板1 μL，空白對照以等量ddH2O代替，補充無菌ddH2O至25 μL。反應條件：65℃1 min，共60個循環(huán)，每個循環(huán)結束時采集熒光信號；反應結束后80℃滅酶2 min；并對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析。

1.3.4.1 反應溫度優(yōu)化

分別將反應溫度設置為61、63、65、67℃，其他條件保持不變，進行real-time LAMP反應。

1.3.4.2 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化

將外引物濃度固定為0.2 μmol/L，根據(jù)內(nèi)外引物濃度比為 4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1共設置 5組試驗組，反應體系中的其他成分保持不變，進行real-time LAMP反應。

1.3.4.3 Mg2+濃度優(yōu)化

將 Mg2+濃度分別設定為 2、4、6、8 mmol/L，其他條件保持不變，進行real-time LAMP反應。

1.3.5 real-time LAMP檢測方法特異性驗證

分別以單增李斯特氏菌標準菌株以及12株非目標菌株對所建立的real-time LAMP體系進行特異性的驗證。熒光擴增曲線為“S”型或類“S”型則判定為陽性。

1.3.6 real-time LAMP檢測方法靈敏度

以10倍梯度稀釋單增李斯特氏菌標準菌株的DNA為模板，以dd H2O作為空白對照，根據(jù)優(yōu)化后的反應條件進行real-time LAMP，確定方法的靈敏度。

1.3.7 DARQ-LAMP方法的建立

QPD探針的孵育：20 μmol/L內(nèi)引物/探針與20 μmol/L標記的探針/內(nèi)引物等體積混合均勻，用錫紙避光包裹，98℃恒溫金屬浴2 min，自然冷卻至室溫26℃，分裝于1.5 mL離心管中，于-20℃冰箱保存。

優(yōu)化前DARQ-LAMP反應體系（20μL）：1.6 μmol/L BIP（0.8 μmol/L BIP 和 0.8 μmol/L QPD），1.6 μmol/L FIP，F(xiàn)3 與 B3 各 0.2 μmol/L，Bst DNA 聚合酶 0.32 U/μL，10×Reation Buffer 2 μL，dNTPs 1.4 mmol/L，Mg2+8 mmol/L，DNA模板1.6 μL，補充無菌蒸餾水至20 μL。反應條件設置為65℃1 min，共60個循環(huán)，每個循環(huán)結束時采集熒光信號；反應結束后80℃滅酶2 min。

1.3.7.1 Bst DNA聚合酶的篩選

選擇Bst DNA聚合酶（大片段）、Bst DNA 2.0聚合酶和Bst DNA 3.0聚合酶進行DARQ-LAMP反應，考察DARQ-LAMP擴增曲線和擴增效率。

1.3.7.2 QPD探針濃度優(yōu)化

由于加入熒光基團和淬滅基團，使整個反應體系更為復雜，QPD在一定的濃度下會抑制LAMP擴增，因此，分別將QPD探針濃度設置為體系的0%、10%、25%、50%、75%、100%，以確定適宜的濃度。

1.3.7.3 Mg2+濃度優(yōu)化

將 Mg2+濃度分別設定為 2、4、6、8 mmol/L，反應體系中其他組成保持不變，進行實時DARQ-LAMP反應。

1.3.8 DARQ-LAMP特異性的評價

以單增李斯特氏菌標準菌株以及12株非目標菌株進行DARQ-LAMP反應，對方法的特異性進行驗證。熒光擴增曲線為“S”型或類“S”型則判定為陽性。

1.3.9 DARQ-LAMP靈敏度的評價

分別以10倍梯度稀釋的目標菌株DNA為模板，以ddH2O為空白對照，根據(jù)優(yōu)化后的反應條件進行DARQLAMP反應，確定方法的靈敏度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗平行進行3次，熒光定量PCR儀中導出LAMP反應擴增曲線，利用GraphPad Prism 8和Origin進行圖像處理分析。

2 結果與分析

2.1 建立檢測單增李斯特菌的real-time LAMP

2.1.1 反應溫度優(yōu)化結果

基于hlyA的real-time LAMP的反應溫度的優(yōu)化結果見圖1。

圖1 基于hlyA的real-time LAMP反應溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the reaction temperature for real-time LAMP based on hlyA

由圖1可知，在63℃時循環(huán)數(shù)閾值（cycle threshold，Ct）值最小，且熒光值最大，為檢測單增李斯特菌的最適宜溫度，此外，溫度為67℃時反應無法進行。

a、b、c、d 分別為 61、63、65、67 ℃下的反應結果。

2.1.2 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化結果

基于hlyA的real-time LAMP內(nèi)外濃度比的優(yōu)化結果見圖2。

圖2 基于hlyA的real-time LAMP反應內(nèi)外引物比的優(yōu)化Fig.2 Optimization of inner to outer primer ratio for real-time LAMP based on hlyA

由圖2可知，當內(nèi)外引濃度物比為6∶1時，反應的Ct值最小，擴增產(chǎn)物熒光值最高，因此該方法的適宜內(nèi)外引物濃度比為6∶1。

2.1.3 Mg2+濃度優(yōu)化結果

基于hlyA的real-time LAMP的Mg2+濃度優(yōu)化結果見圖3。

圖3 基于hlyA的real-time LAMP反應Mg2+濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of Mg2+concentration for real-time LAMP based on hlyA

由圖 3 可知，當 Mg2+濃度在 4、6、8 mmol/L 時，realtime LAMP反應有擴增，Mg2+濃度在2 mmol/L時反應不能正常進行，隨著Mg2+濃度的增加，Ct值變小，且熒光值增強。當Mg2+濃度為6mmol/L時，Ct值最小且熒光值最大，擴增曲線形狀也更好。當Mg2+濃度為8 mmol/L時，Ct值增加，熒光值也減小，由此可見Mg2+濃度過低時反應不能正常進行，而濃度過高則抑制LAMP反應，即基于hlyA的real-time LAMP反應的適宜Mg2+濃度為6 mmol/L。

2.1.4 real-time LAMP檢測方法的特異性

基于hlyA的real-time LAMP的特異性見圖4。

圖4 基于hlyA的real-time LAMP方法的特異性Fig.4 Specificity of the hlyA-based real-time LAMP

由圖4a可知，建立的real-time LAMP檢測方法對目標菌的DNA模板均呈陽性擴增，而12株非目標菌株均無擴增。由圖4b可知，該檢測方法中單增李斯特菌的特征熔解峰的熔解溫度（melting temperature，Tm）為85℃左右。結果表明，以hlyA為靶基因的real-time LAMP方法具有較好的特異性，引物設計可行。

2.1.5 real-time LAMP檢測方法的靈敏度結果

以 10倍梯度稀釋（7.3×100copies/mL～7.3×107copies/mL）的單增李斯特菌的DNA模板進行real-time LAMP反應，結果如圖5。

圖5 基于hlyA的real-time LAMP檢測方法靈敏度Fig.5 Sensitivity of the real-time LAMP based on hlyA

由圖5可知，該方法的檢測限為7.3×101copies/mL。

PCR的靈敏度結果如圖6所示。

圖6 基于hlyA的PCR靈敏度Fig.6 Sensitivity of PCR based on hlyA

由圖6可知，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR的靈敏度為7.3×103copies/mL。real-time LAMP方法是PCR檢測靈敏度的100倍。

2.2 DARQ-LAMP方法的建立

2.2.1 Bst DNA聚合酶的篩選結果

已有研究表明，在反應體系中Bst DNA聚合酶活性會受到熒光劑、淬滅劑的影響，因此Bst DNA聚合酶的選擇對DARQ-LAMP的反應體系有很大的影響。Bst DNA聚合酶的篩選見圖7。

圖7 Bst DNA聚合酶的篩選Fig.7 Screening of Bst DNA polymerases

如圖7所示，以hlyA基因進行DARQ-LAMP反應，Bst DNA LF聚合酶幾乎無擴增反應，Bst DNA 2.0聚合酶雖然有擴增反應，但是其擴增效率太低，而Bst DNA 3.0聚合酶擴增效率高、擴增曲線好，故選擇Bst DNA 3.0聚合酶。

2.2.2 QPD探針濃度優(yōu)化結果

QPD探針濃度設置為體系的0%、10%、25%、50%、75%、100%，結果見圖 8。

圖8 QPD探針濃度優(yōu)化Fig.8 Optimization of QPD concentration

由圖8可知，反應在10%、50%的QPD探針濃度下均可擴增，25%的QPD探針濃度下hlyA基因雖有擴增反應，但是擴增效率低。從整體上看，在50%的QPD探針濃度下雖然熒光值很高，但是基因擴增效率偏低，10%的QPD探針濃度下熒光值在2 000 RFU左右，擴增效率較高，因此選擇10%的QPD探針濃度。

2.2.3 Mg2+濃度優(yōu)化結果

DARQ-LAMP反應Mg2+濃度優(yōu)化見圖9。

圖9 DARQ-LAMP反應Mg2+濃度優(yōu)化Fig.9 Optimization of Mg2+concentration in DARQ-LAMP

由圖9可知，以hlyA為靶基因建立的單重DARQLAMP反應中，Mg2+濃度為6 mmol/L時，DARQ-LAMP擴增效率最高。因此，DARQ-LAMP反應體系的適宜Mg2+濃度為 6 mmol/L。

2.2.4 DARQ-LAMP特異性的評價結果

DARQ-LAMP反應的特異性見圖10。

圖10 DARQ-LAMP反應的特異性Fig.10 Specificity of DARQ-LAMP

由圖10可知，以hlyA基因建立的DARQ-LAMP方法只對靶標反應，非目標菌株均無擴增，表明所建立的DARQ-LAMP方法具有較好的特異性。

2.2.5 DARQ-LAMP靈敏度的評價結果

對DARQ-LAMP方法進行靈敏度分析，結果見圖11。

圖11 DARQ-LAMP的靈敏度Fig.11 Sensitivity of DARQ-LAMP

由圖11可知，以7.3×100copies/mL～7.3×107copies/mL的10倍梯度稀釋的單增李斯特菌DNA模板進行DARQ-LAMP反應，方法的檢測限為7.3×101copies/mL。

3 討論與結論

食源性致病菌一直是引發(fā)食品安全事件的重要因素。傳統(tǒng)的檢測方法雖具有較高的準確性，但需培養(yǎng)及生化實驗，耗費時間長且操作較復雜。近年來一些新方法、新技術逐漸被運用，其中LAMP技術因其具有靈敏度高、特異性強、快速、成本低且不依賴精密儀器的特點，已經(jīng)成為檢測困難樣品的有效分析方法，廣泛應用于食源性疾病的檢測。目前已有較多的傳統(tǒng)LAMP技術應用于檢測中，但因其需要在反應終點開蓋對產(chǎn)物進行染色，無法完全做到特異性識別，且容易造成氣溶膠污染。本研究建立的real-time LAMP方法對單增李斯特菌進行快速檢測，可避免此問題，從而提高特異性。但real-time LAMP技術由于使用的熒光染料易造成假陽性問題，給實際檢測造成不便。

因此，本研究在real-time LAMP方法的基礎上建立DARQ-LAMP方法，分別在對應一條內(nèi)引物的5’端修飾熒光基團（或淬滅基團），并加入一條與F1c（或B1c）部分互補且3’端修飾淬滅基團（或熒光基團）的探針。此時熒光基團和淬滅基團距離相近使熒光淬滅，當目的基因存在時，反應擴增，內(nèi)引物與探針分開，淬滅基團與熒光基團分開，激發(fā)熒光基團發(fā)光，從而進行快速檢測。本方法的適宜反應溫度為63℃、Mg2+濃度為6 mmol/L；通過篩選確定Bst 3.0 DNA聚合酶作為擴增酶，其具有擴增效率高和穩(wěn)定性好的優(yōu)點；QPD探針濃度為10%，在此濃度下，單增李斯特菌的擴增效率較高，熒光值較大。研究表明，建立的單增李斯特菌DARQ-LAMP檢測方法具有較好的特異性和靈敏度，檢測限為7.3×101copies/mL，靈敏度是普通PCR的100倍。

在DARQ-LAMP方法的探針幫助下，能快速準確地對致病菌進行檢測，本研究的結果證明了DARQLAMP方法的可行性，后續(xù)可嘗試建立多重DARQLAMP方法，利用分子拉鏈式循環(huán)擴增，將探針與內(nèi)引物分別標記熒光基團和淬滅基團，雜交形成淬滅探針雙鏈，實現(xiàn)在一個反應管中對多個目的基因的快速、高效檢測。未來可將DARQ-LAMP方法應用于更多種類的食源性致病菌檢測，建立更多的反應體系從而拓寬其在食源性致病菌檢測中的應用范圍。以DARQLAMP方法為基礎的延伸技術在食品安全監(jiān)管領域前景廣闊。然而，單種檢測方法有其局限性，未來可嘗試將這種方法與其他方法結合，將不同方法的優(yōu)勢整合。例如與微流控技術、芯片實驗室等微型實驗室技術相結合，由于其能分隔成多個反應單元，避免了開蓋可能形成的氣溶膠污染等，同時滿足多樣本、多菌種同步定性檢測及鑒定的需求，實現(xiàn)檢測技術的微型化、自動化。未來可研發(fā)試劑消耗少、交叉污染風險小以及更適合對較多靶標進行現(xiàn)場快速檢測的DARQ-LAMP方法，使其具有更廣闊的適用范圍和更強的應用潛力，能快速、精準地檢測食源性致病菌。