高效液相色譜法測定與比較5種不同提取方法提取的茶葉咖啡因

吳以龍，王康，武增才，稅再坤，字成庭2，*

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學普洱茶學教育部重點實驗室，云南 昆明 650201；3.云南農業大學理學院，云南 昆明 650201）

近年來，越來越多的研究證明咖啡因具有興奮心臟、骨骼肌和中樞神經系統、抗氧化、舒張血管、松弛平滑肌等生理作用[1-4]，廣泛存在于瓜拿納、馬黛茶、咖啡樹、茶樹、可樂樹、代茶冬青樹和可可樹的葉片和果實中[5-6]。茶葉是咖啡因的主要來源之一，茶葉中咖啡因的含量占干物質的2%～5%，咖啡因是茶葉中重要的功能成分[7-8]。

咖啡因作為一種傳統的中樞神經系統興奮劑，是世界上應用較為廣泛的精神類藥物，日常生活中的茶葉、咖啡、可可飲料、巧克力以及一些軟飲料等食品中均含有咖啡因[9-10]，其獲取方法主要是從天然作物中進行提取或人工合成[11-14]。從茶葉中提取咖啡因的常用方法有醇提法、水提法、超臨界二氧化碳流體提取法、微波輻射法、恒壓滴液漏斗代替索氏提取器提取法等[15]，但這些提取方法的提取率和純度普遍偏低。目前測定咖啡因提取物純度的方法較多，有薄層色譜法[16-18]、紫外分光光度法[17]和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[19]等。薄層色譜法是一種微量分離方法，其分離速度較快，但存在無法定量和重現性不好等問題。紫外分光光度法利用了咖啡因結構中嘌呤環具有共軛雙鍵體系并能產生獨特吸收光譜的特點，但紫外分光光度法容易受到提取物中其他嘌呤堿的干擾，較純咖啡因的測定才可用紫外分光光度法[20]。本研究討論茶葉中咖啡因的5種提取方法[無水乙醇回流提取濃縮-升華法、丙酮水溶液提取-氯仿萃取法、無水乙醇回流提取濃縮-二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解-凍干法、超聲提取-二氯甲烷萃取法、鹽酸水溶液浸提-二氯甲烷萃取法]，再利用高效液相色譜法測定提取物中咖啡因的含量，根據測定結果比較和分析不同提取方法的優缺點，為茶葉產品開發和深加工過程中咖啡因的分析檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

散裝茶葉（云南省鳳慶縣大葉種茶）：市售；咖啡因標準品（純度＞98%）：中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇、丙酮、氯仿、硫酸鈉、二氯甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、正己烷、活性炭粉（均為分析純）：天津大茂化學試劑廠；氧化鈣、DMSO、三氟乙酸（均為分析純）、甲醇（色譜純）：美國Sigma公司；純凈水：杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-WO-3L恒溫水油浴鍋：河南鄭州鞏義市予華儀器有限責任公司；N-1300V-W型旋轉蒸發儀：日本Eyela/東京理化器械公司；FD-1A-50T型冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；SK5200HP型超聲清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；ME204T型電子天平：上海梅特勒－托利多儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 無水乙醇回流提取濃縮-升華法

稱取5 g散裝茶葉研細均勻，用濾紙包好放入索氏提取器中，然后向250 mL圓底燒瓶中加入70 mL無水乙醇和幾粒沸石，95℃油浴加熱、回流提取3 h，保持回流速度均衡。然后改裝成蒸餾裝置，蒸餾濃縮提取液至適量（1/10體積），將殘液趁熱倒入蒸發皿中，加入4 g氧化鈣，在水浴鍋上80℃蒸干，并不斷攪拌、壓碎塊狀物。然后用小火焙炒片刻至除去水分。冷卻后，擦去蒸發皿上的粉末，用封閉電爐178℃加熱升華，收集得到的咖啡因并稱重（提取方法1）。

1.3.2 丙酮水溶液提取-氯仿萃取法

稱取5 g散裝茶葉研細均勻，加入30%丙酮水溶液70 mL提取2次，每次30 min，合并提取液，用旋轉蒸發儀40℃減壓濃縮至適量（2/3體積），在經正己烷萃取2次后的水相中加入4%硫酸鈉溶液10 mL，用活性炭吸附10 min。氯仿萃取2次，合并有機相，旋轉蒸發儀40℃減壓濃縮回收氯仿，收集得到的咖啡因后干燥并稱重（提取方法2）。

1.3.3 無水乙醇回流提取濃縮-DMSO溶解凍干法

稱取5 g散裝茶葉研細均勻，放入100 mL單口圓底燒瓶中，再加入75mL無水乙醇。在85℃恒溫水浴鍋中回流提取3 h，稍微冷卻后抽濾，濾液用旋轉蒸發儀55℃回收乙醇并濃縮至適量（1/10體積）。濃縮液用DMSO溶解，加入轉子，放在油浴鍋中85℃進行蒸餾，得到含有DMSO和咖啡因的混合液。將混合液置于-80℃超低溫冰箱中預凍4 h以上，凍干機預冷至-48℃，凍干過程中真空度維持在（4±3）Pa，持續凍干72 h以上。經冷凍干燥處理后，收集咖啡因并稱重（提取方法3）。

1.3.4 超聲提取-二氯甲烷萃取法

稱取5 g散裝茶葉研細均勻，置于250 mL圓底燒瓶中，加入75 mL無水乙醇，攪拌使溶劑完全浸潤茶葉，接冷凝回流裝置，在恒溫加熱磁力攪拌器上100℃加熱煮沸10 min，然后置于超聲清洗器中，超聲浸提30 min，冷卻，經減壓抽濾后分離殘渣得到粗提取物。用旋轉蒸發儀55℃回收乙醇并濃縮至適量（1/10體積），加10 mL水溶解后用活性炭吸附10 min，并加入NaOH調節溶液pH值至12左右。用二氯甲烷萃取2次，合并有機相，旋轉蒸發儀37℃回收二氯甲烷，收集得到的咖啡因，干燥并稱重（提取方法4）。

1.3.5 鹽酸水溶液浸提-二氯甲烷萃取法

稱取5 g散裝茶葉研細均勻，置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 2%的鹽酸水溶液浸濕，攪拌浸提20 min，靜置分層，取上層清液，加入NaOH調節pH值至12左右，用二氯甲烷萃取2次，合并有機相，旋轉蒸發儀37℃回收二氯甲烷，收集得到的咖啡因，干燥并稱重（提取方法5）。

1.3.6 標準系列溶液的配制

準確稱取咖啡因標準品5 mg（精確至0.01 mg），置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容并搖勻制得標準品儲備液（1 mg/mL）。精密吸取對照品咖啡因標準品儲備液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到濃度為10、20、40、60、80、100、120 μg/mL 的系列標準液。上述系列濃度標準液經0.45 μm微孔過濾膜過濾后，HPLC進樣分析，以標準品系列濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.7 供試品的制備

精密稱取5種不同提取方法得到的咖啡因各5mg，置于5 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容并搖勻，放置30 min制得1 mg/mL樣品液，將方法1～5提取的咖啡因樣品液編號為A～E。分別精密吸取A～E樣品液（1 mg/mL）1 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，得到0.1 mg/mL的各咖啡因供試品。

1.3.8 色譜條件

色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18柱（5μm×4.6mm×250 mm）；流動相 A：甲醇（0 min：10%→10 min：50%→20 min：70%→25 min：90%），流動相 B：水（0 min：90%→10 min：50%→20 min：30%→25 min：10%）；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：5 μL；檢測波長：280 nm。

1.4 數據統計與分析

色譜圖采用Origin Pro 8.5制作，提取率、線性試驗、回收率和精密度試驗數據由Office Excel軟件處理，數據為3次測定的平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 不同方法提取咖啡因的顏色、形狀及提取率比較

5種提取方法從茶葉中提取咖啡因的結果見表1。

表1 不同方法提取的咖啡因顏色、形狀及提取率比較Table 1 The color and shape of caffeine extracted by different methods and the extraction rate were compared

由表1可知，5種提取方法得到的咖啡因顏色及形狀均較好；同等質量的茶葉，由于提取方法不同，咖啡因的提取率不同，而且差別較大。就上述5種提取方法而言，方法2和方法3的提取率相對較高，方法1、方法4與方法5的提取率偏低，其原因是方法4與方法5提取時間較短，延長提取時間會提高咖啡因的提取率，但超聲與鹽酸溶液輔助提取會增加雜質含量，提取時間不宜過長；方法1在升華過程中由于溫度較難控制，使部分咖啡因在升華過程中碳化損失，部分咖啡因晶體掉落在氧化鈣粉末表面以及結晶在蒸發皿器壁上較難收取。

2.2 HPLC測定咖啡因純度比較

2.2.1 線性試驗、定量限和檢出限

對1.3.6配制的標準系列溶液進行HPLC檢測，線性試驗結果如表2所示，以咖啡因標準溶液質量濃度為橫坐標（C，μg/mL），信號響度峰面積為縱坐標（A），建立標準曲線，該方法線性回歸方程為A=12.59C+172.84，相關系數r為0.999 9，測定咖啡因的含量在濃度10 μg/mL～120 μg/mL呈現良好的線性關系。以3倍信噪比（S/N）計算檢出限，10倍信噪比（S/N）計算定量限。方法的檢出限為2.51 μg/g，定量限為7.87 μg/g。

表2 線性試驗結果Table 2 Results of linear experiment

2.2.2 檢測結果與純度比較

各咖啡因樣品供試品進行HPLC檢測，檢測結果與咖啡因標準品圖譜對照結果見圖1。

由圖1可知，A～E的高效液相色譜中的保留時間與咖啡因標準品的保留時間幾乎一致，且雜質出峰數較少。保留時間、峰面積和純度比較見表3。

表3 高效液相色譜保留時間與峰面積比較Table 3 The retention time and peak area of HPLC were compared

由表3可知，樣品A～E咖啡因純度均＞90%。由于采用外標法測定樣品純度，存在方法誤差與系統誤差，其中樣品E的純度最高達103.29%，在一定的誤差范圍內，樣品E接近咖啡因標準品純度；樣品A純度最低，為90.54%，分析其原因為方法1無水乙醇回流提取濃縮-升華法在咖啡因升華結束后的收取過程中容易摻雜其他雜質，從而略微影響咖啡因的純度。經過HPLC檢測確認了5種不同提取方法的提取效果良好，均能從茶葉中獲得純度良好的咖啡因，HPLC方法準確性較高，能準確分析不同提取方法提取的茶葉咖啡因之間的純度差異。

2.2.3 精密度試驗

分別取 1.3.6 配制的 40、80、120 μg/mL 咖啡因標準溶液按照1.3.8的色譜條件測定峰面積，分別重復測定6次，峰面積的RSD分別為0.31%、0.54%、0.61%，均小于1%，表明HPLC儀器精密度良好。

2.2.4 回收率試驗

精密吸取已知含量的A～E樣品液（1 mg/mL）各1 mL并置于10 mL容量瓶中，每個樣品各3份，分別加入 10 μg/mL 咖啡因標準液 0.5、1、2 mL（即加入 5、10、20 μg咖啡因標準品）并用甲醇定容至10 mL。每個加標量設置3個平行試驗，HPLC測定并記錄峰面積，計算平均回收率，結果見表4。

表4 回收率試驗結果Table 4 Results of recovery experiment

從表4可知，5種咖啡因樣品的平均回收率為92.47%～109.07%，RSD為0.11%～2.77%，表明方法的準確度和精密度較高，適用于咖啡因提取物的檢測分析。

3 討論與結論

提取方法1為從茶葉中提取咖啡因的傳統方法，耗費時間過長，無水乙醇易揮發且索氏提取器易破碎，成本較高。本文用此方法所得咖啡因的純度和提取率都不高，原因在于此方法的關鍵是升華溫度的控制，這直接影響到了咖啡因的提取率和咖啡因純度。提取方法2采用丙酮水溶液作為咖啡因提取劑，丙酮水溶液提取增大了咖啡因的溶出率，氯仿萃取能除去大部分極性低的化合物，咖啡因純度較高。提取方法3采用在水浴鍋中直接冷凝回流提取咖啡因，比起提取方法1的索氏提取器方法，操作要簡單方便，但用此方法提取的咖啡因純度不太高，僅為95.3%。提取方法4采用超聲輔助的方法從茶葉中提取咖啡因，簡化了提取操作且咖啡因純度較好，但是超聲輔助提取咖啡因一方面縮短提取時間，而另一方面又限制提取時間不能過長，原因是超聲時間過長會增大茶葉中雜質的溶出率，咖啡因與雜質較難分離，影響咖啡因純度。提取方法5在5種試驗方法中操作較為簡便、耗時短，但是與方法4相似，酸溶液輔助提取過程中需要嚴格控制提取時間，不然會影響咖啡因的提取率和純度，因此，通常需要探索酸溶液提取時間對咖啡因得率和純度的影響。

利用建立的高效液相色譜法分析5種提取方法從茶葉中提取的咖啡因提取物，能準確分析出不同提取物之間的差異，每種方法都各有優缺點，方法不同導致咖啡因的提取率和純度也有一定差異，但5種提取方法總體上都能達到一般實驗室提取咖啡因的要求。5種提取方法相比較而言，萃取法較為簡便易行，耗時較短，升華法和DMSO溶解-凍干法對儀器和操作要求較高，評價3種萃取法的經濟適用性及結合綠色化學的發展理念，提取方法2的丙酮水溶液提取-氯仿萃取法提取咖啡因效果最佳，咖啡因提取率為1.36%，咖啡因純度能達到97.47%。

本研究建立的咖啡因高效液相色譜分析法具有準確性好和精密度高等優點，可用于咖啡因提取物中咖啡因含量的檢測。