副溶血性弧菌生物被膜動(dòng)態(tài)形成機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組分析

李安琪，石成龍，錢森和，王 洲,*，趙世光,3，劉 艷，薛正蓮

（1.安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000；3.安徽工程大學(xué)宣城產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，安徽 宣城 242000）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌，廣泛分布于河口、海洋和沿海水域[1]，也是全球范圍內(nèi)引起海產(chǎn)品相關(guān)腸胃炎的主要致病菌[2]。副溶血性弧菌感染多與食品安全有關(guān)，多發(fā)生在夏季，經(jīng)常能從魚、蝦、扇貝等海產(chǎn)品中分離出來(lái)[3]。研究表明，副溶血性弧菌能形成生物被膜，且一旦形成很難清除[4]。細(xì)菌群體感應(yīng)、外毒素、IV型分泌系統(tǒng)和鞭毛系統(tǒng)等與生物被膜的形成密切相關(guān)。生物被膜是由自身細(xì)菌分泌基質(zhì)聚合物包裹的微生物群，它能夠定植在生物和非生物表面[5]。被包裹的細(xì)菌能自己產(chǎn)生胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS），如胞外多糖、胞外蛋白、脂質(zhì)和核酸[6]。生物被膜的存在給公共衛(wèi)生帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)，其原因是生物被膜通過EPS的作用保護(hù)菌體免受不良環(huán)境的侵害，生物被膜的存在能增強(qiáng)菌體抵抗紫外線[7]、抗生素[8]和其他外部壓力高度耐受的能力[9]。

生物被膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及細(xì)菌生理特性變化和多種基因調(diào)控。從以往研究可以知道，生物被膜形成大致分為5 個(gè)過程：可逆黏附階段、不可逆黏附階段、微菌落形成階段、生物被膜成熟階段、生物被膜解離階段，解離后將進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)[10]。第1階段：細(xì)菌菌毛和鞭毛加強(qiáng)了細(xì)菌與附著表面的相互作用[11]，并且在范德華力和疏水相互作用可逆地附著在固體基質(zhì)表面[12]；第2階段：細(xì)胞不可逆地依附在固體物質(zhì)表面；第3階段：附著的細(xì)菌逐漸繁殖聚集，構(gòu)成微菌落，并伴隨EPS的分泌[13]；第4階段：這些微菌落進(jìn)一步發(fā)展成“蘑菇狀”的三維立體結(jié)構(gòu)[14]，這是生物被膜成熟的標(biāo)志；第5階段：生物被膜出現(xiàn)孔洞，通過細(xì)胞自溶破壞基質(zhì)以釋放分散的細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)[15]。總之，生物被膜的動(dòng)態(tài)形成過程是一個(gè)無(wú)休止的循環(huán)。

目前對(duì)副溶血性弧菌生物被膜的研究主要集中在生物被膜形成條件和耐藥性機(jī)制[16-17]。然而，細(xì)菌從浮游細(xì)胞狀態(tài)向生物被膜狀態(tài)的轉(zhuǎn)化過程及其適應(yīng)機(jī)制尚未闡明。因此，為了解細(xì)菌在生物被膜動(dòng)態(tài)形成過程中基因表達(dá)的變化與生物被膜之間的關(guān)系，研究2 株生物被膜差異菌株的生理生化特性，并在此基礎(chǔ)上對(duì)生物被膜形成前期和后期的生被膜菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。本研究結(jié)果將有助于豐富副溶血性弧菌生物被膜形成機(jī)制研究，為生物被膜防控提供一定理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

副溶血性弧菌VP-0為實(shí)驗(yàn)室保存，ATCC 17802、LMG 16843、CATM 1807、MCCC11C 2691、MCCC1A14234均由中國(guó)海洋微生物菌種保藏中心惠贈(zèng)；哈維氏弧菌ATCC BAA-1117購(gòu)買于上海保藏生物技術(shù)中心，用于檢測(cè)AI-2。

2216E液體培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫、苯酚、硫酸 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒、BCA試劑盒生工生物工程（上海）股份有限公司；SYTO-9核酸染料美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan FC型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；ZQZY-AS8搖床 上海知楚儀器有限公司；2100生物分析儀 美國(guó)Agilent公司；TCS SP8激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）德國(guó)Leica公司；F-4500熒光光譜儀 日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

取一環(huán)甘油管中保存的菌體在2216E固體培養(yǎng)基中劃線活化，37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)15～20 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在無(wú)菌條件下挑取單菌落接種于2216E液體培養(yǎng)基中，200 r/min振蕩培養(yǎng)備用。

1.3.2 改良微孔板法檢測(cè)生物被膜

采用結(jié)晶紫法測(cè)定生物被膜的形成能力[18]，并進(jìn)行細(xì)微改動(dòng)。具體方法如下：將過夜培養(yǎng)的菌液調(diào)整OD600nm＝0.4～0.5，將200 μL菌液等分加入96 孔板中，于37 ℃分別靜置培養(yǎng)到4、8、20、24、36、48、72、96 h（每個(gè)時(shí)間段重復(fù)8 個(gè)孔）。倒出孔中的培養(yǎng)物，用蒸餾水洗滌孔板兩次，再置于干燥箱中干燥。每孔中加入等量的0.1 g/100 mL結(jié)晶紫溶液200 μL染色10 min，然后用蒸餾水沖去多余染料，烘干10 min，再用200 μL 95%乙醇溶液溶解15 min。使用酶標(biāo)儀分別在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每個(gè)孔的吸光度，僅含培養(yǎng)基孔板和空白孔作為對(duì)照。

1.3.3 信號(hào)分子AI-2的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[19]，用哈氏弧菌BB170測(cè)定信號(hào)分子AI-2活性。轉(zhuǎn)接后的哈氏弧菌BB170在AB（autoinducer bioassay）培養(yǎng)基，于30 ℃振蕩培養(yǎng)到OD600nm＝1.5～2.0之間。并以1∶5000比例稀釋后轉(zhuǎn)接到新鮮的AB培養(yǎng)基中，得到稀釋的哈唯氏弧菌BB170菌液。再吸取1 mL不同時(shí)期0.22 μm濾器過濾的副溶血性弧菌上清液、哈氏弧菌BB170上清液、AB培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基，分別作為檢測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和介質(zhì)對(duì)照，與9 mL哈氏弧菌BB170稀釋液混合后加入滅菌后的試管中，振蕩5 s后，于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，測(cè)定熒光強(qiáng)度（U），每組樣品均重復(fù)3 孔。用相對(duì)熒光強(qiáng)度表示AI-2信號(hào)分子濃度，計(jì)算公式如下[20]：陽(yáng)性對(duì)照組相對(duì)熒光強(qiáng)度＝陽(yáng)性對(duì)照熒光強(qiáng)度值/陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度值；實(shí)驗(yàn)組相對(duì)熒光強(qiáng)度＝實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度值/介質(zhì)對(duì)照熒光強(qiáng)度值。

1.3.4 EPS檢測(cè)

參考1.3.2 節(jié)方法培養(yǎng)生物被膜，吸取培養(yǎng)液8000×g離心10 min，收集上清液測(cè)定水溶性胞外多糖含量。具體步驟如下[21]：無(wú)細(xì)胞上清液加入3 倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃沉淀過夜，8000×g離心后上清液，沉淀物溶解于無(wú)菌水中，用Sevag法脫蛋白，然后收集沉淀物用苯酚-硫酸法測(cè)定OD595nm值。

胞外蛋白測(cè)定參考文獻(xiàn)[22]，去除上清液的孔板用無(wú)菌水清洗干凈，刮取生物被膜加入0.14 mol/L NaCl溶液混合超聲，10000×g離心20 min，吸取200 μL上清液0.22 μm濾器過濾后用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

按照1.3.2節(jié)方法培養(yǎng)生物被膜，培養(yǎng)到不同時(shí)間（8、48、72、96 h）吸取菌液，4000×g離心10 min獲得菌體，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溫和洗滌收集的菌體，輕輕搖勻。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行染色，并在2 h內(nèi)進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3.6 CLSM觀察

培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的新鮮菌液置于無(wú)菌12 孔板中，放入無(wú)菌蓋玻片，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h和96 h。培養(yǎng)結(jié)束后小心移除培養(yǎng)基用無(wú)菌PBS洗滌蓋玻片，并加入2.5%的戊二醛溶液固定30 min。然后加入Syto-9置于暗室中染色15 min，再取出蓋玻片再用PBS沖洗3 次，最后用CLSM進(jìn)行觀察[23]。

1.3.7 RNA的提取與樣本檢測(cè)

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作委托北京諾和致源公司完成。通過對(duì)上述菌株生理特性的測(cè)定選取供試菌株ATCC 17802作為后續(xù)研究材料。將靜置培養(yǎng)到8、48 h和72 h的生物被膜菌作為檢測(cè)樣本。用Trizol法提取RNA，并通過2100生物分析儀進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，精確無(wú)誤地對(duì)RNA的完整性和含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.8 文庫(kù)構(gòu)建與上機(jī)檢測(cè)

質(zhì)檢合格獲得的樣品經(jīng)處理，得到mRNA隨機(jī)打斷的短片段，并按照鏈特異性建庫(kù)的方式建庫(kù)[24]，之后借助Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

對(duì)3 組樣本93962274 條原始測(cè)序reads進(jìn)行過濾，對(duì)樣本的原始測(cè)序reads、有效reads、Q30和GC相對(duì)含量進(jìn)行計(jì)算。并且，為了更好地探究3 個(gè)不同被膜菌在基因表達(dá)水平和通路上的差異，通過ClusterProfiler軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有圖形均通過Origin 2018繪制，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，3 個(gè)平行。數(shù)據(jù)以表示，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物被膜形成趨勢(shì)

由圖1A可知，實(shí)驗(yàn)所涉及的6 株供試菌株生物被膜的形成均先增加后減少，再增加到峰值又減少的趨勢(shì)。可以基本判定0～12 h為可逆黏附階段，12～48 h為不可逆黏附和微菌落形成階段，48～72 h為成熟階段，72～144 h為解離階段。由圖1B可知，生物被膜成熟期72 h時(shí)菌株ATCC 17802的成膜能力強(qiáng)于VP-0，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)生物被膜開始解離，這與圖1C結(jié)晶紫染色后的結(jié)果一致。副溶血性弧菌ATCC 17802和VP-0具有相似的成膜趨勢(shì)，且靜置培養(yǎng)72 h的成膜能力顯著強(qiáng)于（P＜0.05）其他菌株，可以作為后續(xù)研究材料。事實(shí)上，有研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜的形成存在一定時(shí)間規(guī)律。丁文艷等[25]的研究中，副溶血性弧菌F29的生物被膜在48 h成熟，并在72 h發(fā)生脫落。除此之外，等在關(guān)于副溶血性弧菌生物被膜形成規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)果不同的原因可能是由于菌株的不同和培養(yǎng)條件差異。

圖1 生物被膜形成能力Fig.1 Biofilm formation ability

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌黏附在介質(zhì)表面是生物被膜形成的先決條件，初始黏附作用促進(jìn)了生物被膜的發(fā)育和成熟[26]。本研究菌株ATCC 17802在初始階段的黏附性強(qiáng)于其他菌株，而表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物被膜形成能力，這也為后期生物被膜的發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。在生物被膜形成的過程中，會(huì)逐漸產(chǎn)生成熟的生物被膜，部分細(xì)菌被包裹在具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞基質(zhì)中，這種基質(zhì)充當(dāng)了穩(wěn)定生物被膜結(jié)構(gòu)的支架[27]。當(dāng)外在氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等不充足時(shí)，生物被膜內(nèi)部分細(xì)菌出現(xiàn)死亡，生物被膜厚度減少[28]。生物被膜解離后，細(xì)菌從基質(zhì)脫落出來(lái)，成為浮游狀態(tài)分散到環(huán)境中開始新一輪的黏附[29]。

2.2 信號(hào)分子AI-2檢測(cè)結(jié)果

生物被膜形成過程受細(xì)菌群體感應(yīng)途徑調(diào)控[30]。群體感應(yīng)是一種受細(xì)菌種群的密度調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制。當(dāng)細(xì)菌密度增加到一定閾值時(shí)，細(xì)菌就會(huì)釋放一種自誘導(dǎo)物AI-2。而隨著環(huán)境中AI-2濃度的增加，相關(guān)基因隨之表達(dá)。如圖2所示，隨著生物被膜的培養(yǎng)，兩株被膜形成差異菌株的信號(hào)分子AI-2呈上升趨勢(shì)，并且在72 h被膜成熟期達(dá)到最大值，生物被膜進(jìn)入解離期時(shí)，AI-2濃度有所下降，這與生物被膜形成量趨勢(shì)相一致（圖1）。兩株被膜差異菌株在信號(hào)分子AI-2在含量上沒有顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)，AI-2能促進(jìn)大腸桿菌和變形鏈球菌的生物被膜形成[31]。同樣地，在本實(shí)驗(yàn)中兩株菌生物被膜的形成趨勢(shì)與各自AI-2變化趨勢(shì)基本一致。張君怡等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌上清液中的AI-2和生物被膜量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，二者呈正相關(guān)性。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致，推測(cè)AI-2不僅與生物被膜形成有關(guān)，且變化趨勢(shì)與生物被膜形成趨勢(shì)存在一定相關(guān)性。

圖2 信號(hào)分子AI-2動(dòng)態(tài)檢測(cè)Fig.2 Changes in content of signaling molecule AI-2

2.3 EPS分析

由圖3可知，在本實(shí)驗(yàn)中，隨著生物被膜的成熟，胞外多糖和胞外蛋白逐漸增多，并在被膜成熟期48～72 h含量迅速增加。此時(shí)ATCC 17802的胞外多糖和蛋白含量分別是VP-0的1.67 倍和2.3 倍。之后隨著生物被膜的分解，兩株供試菌胞外多糖和蛋白的含量均開始下降。由此可知，EPS的產(chǎn)生在生物被膜的成熟階段起著最重要的作用。

圖3 生物被膜EPS檢測(cè)Fig.3 Changes in contents of extracellular polysaccharide and protein in biofilms

EPS能夠介導(dǎo)細(xì)菌的表面黏附并保護(hù)細(xì)菌免受惡劣環(huán)境的影響[33]。其中胞外多糖最重要的功能之一是可作為胞外基質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)元素，通過相互作用決定生物被膜的機(jī)械穩(wěn)定性和黏附[34]。已有的研究表明，可溶性多糖經(jīng)常被用作生物被膜中細(xì)胞的緊急外部能量庫(kù)，甚至可以在不利的環(huán)境中提供能量[35]。而作為EPS另一個(gè)重要組分的胞外蛋白有助于生物被膜的形成和維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[36]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了胞外多糖和胞外蛋白與生物被膜形成的一致性。

2.4 細(xì)胞膜滲透性

Annexin V/PI雙染法可以通過Annexin V和PI的不同特性進(jìn)行滲透性檢測(cè)，借助流式細(xì)胞儀可以清楚區(qū)分不同狀態(tài)的細(xì)菌[37]。本實(shí)驗(yàn)中第1象限（AV-/PI+）和第2象限（AV+/PI+）為滲透性較高的細(xì)菌，PI能夠順利進(jìn)入細(xì)胞膜并染色。第3象限（AV-/PI-）為正常細(xì)菌，第4象限（AV+/PI-）細(xì)菌磷脂酰絲氨酸有外翻，但細(xì)胞膜依然完整。

細(xì)菌滲透性的增加有利于EPS分泌。從圖4可知，細(xì)胞膜的滲透性也發(fā)生改變，處在生物被膜形成期時(shí)（8、48、72 h）的兩株供試菌株的細(xì)胞膜滲透性，均高于生物被膜解離期（96 h）。在生物被膜解離期細(xì)菌分泌EPS減少且部分細(xì)菌處于休眠狀態(tài)，也因此細(xì)胞膜滲透性處于較低水平。在生物被膜形成期（8、48、72 h）成膜能力較強(qiáng)的ATCC 17802細(xì)胞滲透性高于成膜能力較弱的菌株VP-0。這也說明滲透性對(duì)生物被膜的形成具有重要作用，在生物被膜成熟期0～72 h保持較高的滲透性。

圖4 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞膜滲透性Fig.4 Changes in cell membrane permeability detected by Annexin V/PI double staining

2.5 CLSM觀察

副溶血性弧菌ATCC 17802和VP-0形成成熟生物被膜的CLSM如圖5所示。可以看出，在48 h（圖5A、B）成膜能力強(qiáng)的菌株ATCC 17802細(xì)菌較VP-0呈現(xiàn)更集聚集的狀態(tài)。在成熟期（48～72 h）有大量菌體聚集分泌多糖和蛋白，并被胞外分泌物質(zhì)包裹其中，抗逆性增強(qiáng)。隨著生物被膜的解離，到96 h（圖5C、D）時(shí)生物量有所減少，多糖和蛋白含量也隨之減少。這與對(duì)生物被膜含量的檢測(cè)結(jié)果相似，也進(jìn)一步表明在生物被膜形成過程中，成膜能力強(qiáng)的菌株ATCC 17802黏附在介質(zhì)表面的能力強(qiáng)于VP-0。

圖5 CLSM觀察生物被膜Fig.5 CLSM observation of biofilms

2.6 轉(zhuǎn)錄組分析

2.6.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

對(duì)93962274 條原始測(cè)序reads進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量有效reads共92506128 條（表1）。6 組樣本的堿基測(cè)序精確度Q30值均達(dá)到95%以上，GC含量超過46%，說明測(cè)序錯(cuò)誤較少且質(zhì)量較高，可進(jìn)行下一步分析。將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登記號(hào)為PRJNA784512。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)Table 1 Transcriptomic sequencing data

2.6.2 差異表達(dá)基因篩選及表達(dá)聚類分析

分別從48 h vs 8 h、72 h vs 8 h比較組中，篩選得到1061 個(gè)和802 個(gè)差異表達(dá)基因（P＜0.05，|log2Fold Change|≥1），以靜置培養(yǎng)8 h樣本為對(duì)照時(shí)，48 h樣本和72 h樣本中，ATCC 17802基因表達(dá)上調(diào)分別為406 個(gè)和296 個(gè)，表達(dá)下調(diào)數(shù)量分別為655 個(gè)和606 個(gè)。72 h樣本和48 h樣本比較，差異表達(dá)基因共267 個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)基因171 個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因96 個(gè)（圖6A）。結(jié)果表明，生物被膜成熟期（72 h和48 h）與生物被膜形成黏附期（8 h）相比較存在較大的基因差異，生物被膜形成受多種基因調(diào)控。

圖6 生物被膜形成過程中差異基因表達(dá)情況Fig.6 Differential gene expression during biofilm formation

對(duì)基因表達(dá)值進(jìn)行聚類分析，并對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)的行進(jìn)行均一化處理。圖6B表示差異基因FPKM（fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced）歸一化后的數(shù)值。可知RNA-Seq數(shù)據(jù)良好，3 個(gè)時(shí)間段基因表達(dá)差異明顯，可進(jìn)行后續(xù)基因注釋分析。

2.6.3 生物被膜形成階段差異基因的GO功能注釋

將篩選到的差異基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)，有助于對(duì)基因功能進(jìn)行挖掘。GO富集分析以P＜0.05、|log2Fold Change|≥1作為標(biāo)準(zhǔn)，將生物被膜形成前期（48 h vs 8 h）比較組的差異基因分別注釋到生物學(xué)過程、細(xì)胞組分以及分子功能3 個(gè)大類（圖7A）。48 h vs 8 h處理組注釋差異基因到3 個(gè)大類，32 個(gè)亞類，在生物過程中注釋的條目最多，其中涉及翻譯、多組織過程、肽的合成、細(xì)胞酰胺代謝過程、ATP代謝過程、有機(jī)氮化合物生物合成過程和跨膜運(yùn)輸，多數(shù)表現(xiàn)基因下調(diào)；在細(xì)胞組分類別下，主要涉及細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器以及核蛋白復(fù)合物，表現(xiàn)較多的差異基因，且多為下調(diào)；在分子功能類別中，核糖體結(jié)構(gòu)成分、結(jié)構(gòu)分子活性、質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、氧化還原酶活性等條目下表達(dá)差異基因數(shù)量較多，并表現(xiàn)基因下調(diào)特性。

圖7 差異基因GO富集及功能注釋Fig.7 GO enrichment and functional annotation of differentially expressed genes

在靜置培養(yǎng)72 h后，生物被膜進(jìn)入成熟后期，由圖7B可知，72 h與48 h處理組比較，注釋差異基因到3 個(gè)大類，14 個(gè)亞類，在生物過程類別中，氧化還原過程、α-氨基酸代謝過程、應(yīng)激響應(yīng)過程、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、種間互作等表現(xiàn)顯著差異；在細(xì)胞組分類別中，僅外膜表現(xiàn)顯著差異；而在分子功能類別中，絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、氧化還原酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、羧酸酯水解酶活性等表現(xiàn)顯著差異。

2.6.4 生物被膜形成階段差異基因的KEGG代謝通路分析

結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組差異顯著基因所參與的代謝通路進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖8所示，分別以通路基因比值、富集基因數(shù)目、P值為指標(biāo)，進(jìn)行相關(guān)代謝通路的分析。在48 h與8 h處理組比較中，差異基因主要參與了核糖體、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、氧化磷酸化、次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、不同環(huán)境下的微生物代謝、碳代謝等相關(guān)通路，共涉及22 種代謝通路；在72 h與48 h處理組的比較中，差異基因主要參與乙醛酸和二羧酸代謝、不同環(huán)境下的微生物代謝、碳代謝、丙酮酸鹽代謝、脂肪酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、群體感應(yīng)等通路，共涉及22 種代謝通路。

圖8 差異基因KEGG富集到的主要代謝通路Fig.8 Major KEGG metabolic pathways enriched with differentially expressed genes

2.7 生物被膜相關(guān)差異基因挖掘

為深入挖掘與生物被膜相關(guān)差異基因的變化，了解生物被膜動(dòng)態(tài)形成過程中的差異，對(duì)富集的差異基因進(jìn)行分析。FPKM是目前常用的基因表達(dá)水平估算方法[38]。基因表達(dá)量以FPKM表示，結(jié)果如表2所示。

生物被膜的形成與細(xì)菌群體感應(yīng)信號(hào)分子的表達(dá)與識(shí)別有關(guān)，信號(hào)分子的合成與傳遞是微生物環(huán)境適應(yīng)性的一種調(diào)節(jié)方式。在信號(hào)分子AI-2達(dá)到一定閾值時(shí)，會(huì)被膜上的受體識(shí)別，進(jìn)而調(diào)控胞內(nèi)一系列基因的表達(dá)[39]。由表2可知，本實(shí)驗(yàn)中可逆黏附期（8 h）AI-2大量合成，此時(shí)AI-2合成調(diào)控基因（luxS）高表達(dá)。當(dāng)信號(hào)分子積累到一定閾值時(shí)，AI-2受體蛋白基因（luxQ和luxP）上調(diào)，并在被膜成熟后（72 h）下調(diào)。且細(xì)胞密度處于高水平時(shí)，opaR會(huì)大量表達(dá)與exsBAD-vscBCD啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合，此時(shí)在opaR作用下，T3SS分泌系統(tǒng)相關(guān)基因出現(xiàn)下調(diào)[40]。研究表明，T3SS分泌系統(tǒng)影響生物被膜的形成、運(yùn)動(dòng)性和細(xì)菌存活能力[41]。

表2 生物被膜相關(guān)部分差異表達(dá)基因Table 2 Differentially expressed genes related to biofilm

2.8 能量代謝相關(guān)差異基因挖掘

糖酵解途徑能將葡萄糖分解為兩分子丙酮酸并提供能量，此過程分為準(zhǔn)備階段和放能階段兩個(gè)部分[42]。在生物被膜形成過程中，準(zhǔn)備階段的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸果糖激酶和放能階段的磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶均有一致變化，在可逆黏附（8 h）到生物被膜成熟前期（48 h）過程中，上述基因上調(diào)；在生物被膜成熟后期（72 h），上述基因表達(dá)下調(diào)（表3）。

在胞漿進(jìn)行的戊糖磷酸途徑能通過氧化葡萄糖得到6 分子CO2和12 單位強(qiáng)還原力的NADPH[43]，其限速酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因在可逆黏附（8 h）到生物被膜成熟前期（48 h）過程中，基因上調(diào)，在生物被膜成熟后期（72 h）基因表達(dá)下調(diào)（表3）。

表3 能量代謝相關(guān)部分差異表達(dá)基因Table 3 Energy metabolism-related differentially expressed genes

糖酵解和戊糖磷酸途徑能為機(jī)體提供還原能，推測(cè)在生物被膜可逆黏附期到成熟期過程中菌體需要還原能，用于合成大量蛋白質(zhì)和多糖，所以調(diào)控基因上調(diào)。在成熟后期需求減少，相關(guān)基因下調(diào)，此時(shí)被膜成熟，細(xì)菌體內(nèi)代謝減少，保存能量。

2.9 鞭毛合成相關(guān)差異基因挖掘

在許多細(xì)菌中，鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性在生物被膜形成的初始階段發(fā)揮重要作用[44]。細(xì)菌需要借助鞭毛的作用，運(yùn)動(dòng)到固體表面增加其黏附和聚集，從而促進(jìn)生物被膜的形成，在定植完成后，運(yùn)動(dòng)相關(guān)基因會(huì)關(guān)閉[45]。

如表4所示，在可逆黏附（8 h）到生物被膜成熟前期（48 h）過程中，鞭毛組裝蛋白合成普遍下調(diào)，其中鞭毛反σ因子（flgM）表達(dá)量有所增加，鞭毛調(diào)控蛋白FlgM對(duì)鞭毛轉(zhuǎn)錄的2級(jí)和3級(jí)操縱子起到負(fù)調(diào)控作用[46]，這些直接導(dǎo)致菌體運(yùn)動(dòng)能力減弱。

表4 鞭毛相關(guān)部分差異表達(dá)基因Table 4 Flagellum-associated differentially expressed genes

2.10 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)差異基因挖掘

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大量存在于原核生物中，能借助ATP釋放的能量協(xié)助多種物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。對(duì)生物被膜菌形成過程中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行分析，表5展示了主要差異蛋白基因：麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（malK、malE、malF、malG）、精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（artM、artQ、artP）和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（oppB、oppC、oppD、oppF）。

表5 轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)部分差異表達(dá)基因Table 5 Transport-related differentially expressed genes

寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因持續(xù)下調(diào)，而麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因在可逆黏附期（8 h）到生物被膜成熟前期（48 h）過程中，基因表達(dá)下調(diào)，在生物被膜成熟后期（72 h）基因表達(dá)上調(diào)。而寡肽蛋白表達(dá)持續(xù)下調(diào)表明被膜菌對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)能力減弱，耐藥性增強(qiáng)。

3 結(jié)論

有研究表明，細(xì)菌在不適宜環(huán)境中會(huì)通過分泌EPS形成生物被膜的形式將自身細(xì)菌包裹，生物被膜受多種基因調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程[47]。生物被膜形成涉及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)、黏附、EPS分泌和能量轉(zhuǎn)換等多種變化。在此過程中，細(xì)菌的一系列生理生化變化和調(diào)控基因的變化是需要研究的重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)6 株副溶血性弧菌的生物被膜形成能力進(jìn)行測(cè)定，篩選出成膜差異大的2 個(gè)菌株作為供試菌株。與成膜能力差的菌株VP-0相比，成膜能力較強(qiáng)的ATCC 17802菌株信號(hào)分子AI-2的釋放量沒有明顯差異，胞外多糖和胞外蛋白的分泌量顯著高于VP-0，細(xì)胞膜滲透性更高，且生物被膜成熟期細(xì)菌呈現(xiàn)更聚集的狀態(tài)。

副溶血性弧菌ATCC 17802被膜菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，處理組72 h vs 8 h、48 h vs 8 h和72 h vs 48 h差異基因分別為802（上調(diào)506，下調(diào)296）、1061 個(gè)（上調(diào)655，下調(diào)406）和267 個(gè)（上調(diào)96，下調(diào)171）。通過差異表達(dá)基因GO富集分析可知，生物被膜成熟期與黏附期比較，差異基因主要富集在化合物合成、蛋白質(zhì)代謝過程中。差異基因注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，在48 h與8 h處理組比較中，差異基因主要參與了核糖體、細(xì)菌分泌系統(tǒng)、生物合成、不同環(huán)境下的微生物代謝和碳代謝等相關(guān)通路，共涉及22 種代謝通路；在72 h與48 h處理組的比較中，差異基因主要參與生物代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和群體感應(yīng)等通路，共涉及22 種代謝通路。

綜上所述，在可逆黏附期（8 h）階段，副溶血性弧菌通過AI-2的合成與累積，調(diào)節(jié)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。進(jìn)入生物被膜成熟前期（48 h），其代謝增加，運(yùn)動(dòng)能力減弱，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因上調(diào)，EPS分泌增加；在生物被膜成熟后期（72 h），細(xì)菌代謝減少，寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因下調(diào)，耐藥性增加。這些研究結(jié)果為生物被膜形成機(jī)制的研究提供了一定理論支持。