Time-lapse技術聯合一步法培養對胚胎發育及妊娠結局的影響

朱霞，鄒薇，李慧珍，吳衛豐，馬明男，馬天仲*

(1.廣東醫科大學附屬醫院生殖中心，湛江 524001；2.廣東醫科大學第一臨床醫學院，湛江 524001)

據全球人口統計調查，估計21世紀受不孕癥影響的有1.86億人，約占8%～12%，男女比例持平，大多數是在發展中國家；在我國，不孕率占25%，且總體發病率仍在上升[1-2]。越來越多育齡期婦女需要通過輔助生殖技術(ART)才能獲得妊娠。國內生殖中心通過選擇移植2枚或以上胚胎，來提高單次移植的成功妊娠率，這導致了多胎妊娠率居高不下，是目前ART中最常見的并發癥之一，也導致妊娠期間并發癥隨之升高。針對不孕患者挑選優質胚胎、提高臨床妊娠率、減少多胎并發癥是目前生殖醫生面臨的難題。時差成像(time-lapse imaging TLI)系統作為一種新型胚胎培養及檢測系統，與常規低氧胚胎培養箱相比，TLI培養箱一步法培養能避免胚胎被多次移出培養箱觀察，不僅能為胚胎發育提供穩定安全的培養環境，還可以獲得更多的胚胎動力學參數，能動態評估胚胎發育潛能[3-4]。有研究表明胚胎形態學評分結合胚胎動力學參數可以挑選最優發育的胚胎進行移植，提高種植率從而改善妊娠結局[5]。本研究旨在分析TLI培養方式和常規低氧培養方式對胚胎培養及臨床妊娠結局的影響，探討TLI培養箱是否有利于挑選高潛能胚胎，為TLI技術的實際應用提供參考信息。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2020年12月至2022年5月在廣東醫科大學附屬醫院生殖中心接受體外受精或卵胞漿內單精子顯微注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治療的年輕患者臨床資料。

納入標準：(1)首次促排卵行IVF/ICSI-ET助孕；(2)20≤年齡≤35歲；(3)獲卵數≥5個；(4)資料周期完整。

排除標準：(1)子宮畸形、雙子宮和雙陰道者；(2)移植日內膜<7 mm，宮腔積液者；(3)夫妻任一方存在染色體異常者；(4)無可移植胚胎者。

本研究共納入571名患者，按胚胎培養方式不同，分為TLI組(n=254)和常規低氧培養箱組(n=317)兩組。根據胚胎移植類型分為D3卵裂期胚胎移植組(TLI組127例，常規培養組127例)和D5囊胚移植組(TLI組99例，常規培養組143例)。入選研究對象包含處于妊娠狀態的患者。

二、研究方法

1.促排卵及取卵：根據患者情況制定個性化治療方案，結合B超及激素水平檢測卵泡生長情況，待至少2個卵泡直徑≥18 mm或3個卵泡直徑≥17 mm時，立即肌肉注射HCG 5 000～10 000 U(珠海麗珠)或艾澤250 μg(默克，德國)進行扳機，35～37 h后在B超引導下經陰道穿刺取卵。

2.受精、胚胎培養：男方禁欲3～7 d，于取卵當日通過手淫取精。根據患者個人情況行IVF/ICSI助孕。常規低氧組行序貫法培養：正常受精卵第1天轉移至G-1TMPLUS卵裂培養滴(Vitrolife，瑞典)并置于COOK(K-MINC-100，COOK，澳大利亞)臺式培養箱中37℃、6%CO2、5%O2條件下培養至第3天，放置入G-2TMPLUS囊胚培養液(Vitrolife，瑞典)培養至第6天。TLI組行一步法培養：將正常受精胚胎轉移至G-TL培養液(Vitrolife，瑞典)并置于ESD(EmbryoScope Version D，Vitrolife，丹麥)培養箱內37℃、6%CO2、5%O2條件下培養至第6天。

3.胚胎質量評估：常規組胚胎體外培養根據細胞數目、卵裂球的形態、均一度及碎片進行評分，優質胚胎參照胚胎實驗室關鍵指標質控專家共識[6]。TLI組培養每10 min拍攝一次結合KIDscore分析胚胎發育的每個階段時間和形態學對胚胎評分，胚胎形態學根據伊斯坦布爾共識[6]及Gardner囊胚評分標準[7]對胚胎質量評估；可利用胚胎和優質胚胎指標參照胚胎實驗室關鍵指標質控專家共識[8]。

4.胚胎移植：新鮮胚胎移植者在取卵后選擇第3天移植1～2枚卵裂期胚胎或第5天移植1～2枚囊胚。凍融胚胎移植者擇期移植1～2枚卵裂期胚胎或移植1～2枚囊胚。新鮮周期和冷凍周期移植后均給予常規黃體支持(達芙通，雅培，荷蘭；或雪諾酮，默克，德國；或黃體酮針劑，浙江仙琚)。

5.隨訪：移植14 d/12 d(卵裂期/囊胚)后查血清β-HCG，若β-HCG>5 U/L則為HCG陽性，移植后4～6周行陰道B超，發現孕囊、胎心確認臨床妊娠。

6.觀察指標：(1)患者的一般資料；(2)胚胎培養情況，主要有優胚率、囊胚形成率、卵裂胚胎利用率；(3)妊娠結局，包括臨床妊娠率和種植率。優胚率=優質胚胎數/正常受精卵裂數；囊胚形成率=囊胚形成數/培養囊胚數；卵裂胚胎利用率=可用卵裂胚胎數/培養卵裂胚胎總數；臨床妊娠率=臨床妊娠患者數/移植周期數，種植率=著床胚胎數/移植胚胎數。

三、統計學分析

結 果

一、患者一般資料

共納入571例患者，其中TLI系統培養組(TLI組)254例，常規培養組(常規組)317例。兩組患者間年齡、不孕年限、不孕類型、受精方式、抗苗勒管激素(AMH)水平、體質量指數(BMI)、Gn總量、獲卵數以及基礎性激素(FSH、E2、LH)水平的差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較[(-±s)，n(%)]

續表

二、兩組患者的胚胎培養情況

常規組的2PN卵裂數、優胚率、成熟卵母細胞率、總受精率均高于TLI組(P<0.05)，兩組患者優胚數、囊胚數、MⅡ卵母細胞數、受精總數、2PN數、卵裂總數、囊胚形成率、2PN率、2PN卵裂率以及卵裂胚胎利用率的差異均無統計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者胚胎培養結局比較[M(P25，P75)，%]

三、兩組患者胚胎移植的妊娠結局

根據胚胎移植類型的不同，將患者分為D3卵裂期胚胎移植組和D5囊胚移植組，分別統計不同胚胎移植類型下兩種胚胎培養模式的妊娠結局差異。

1.D3卵裂期胚胎移植時兩組患者的妊娠結局：D3卵裂期胚胎移植包括TLI組127例和常規組127例。統計結果顯示，常規組的移植胚胎數顯著高于TLI組(P<0.05)；兩組患者間的胚胎著床數、胚胎種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率及雙胎率均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者D3胚胎移植妊娠結局比較[(-±s)，%]

D3卵裂期胚胎移植時，本中心會移植1～2枚胚胎，根據移植胚胎數又做進一步的分析，分別對移植1枚和移植2枚的患者進行了比較。在D3卵裂期移植1枚胚胎時，TLI組的著床數及種植率雖然均高于常規組，但差異尚無統計學意義(P>0.05)(表4)。D3卵裂期移植2枚胚胎時，TLI組的種植率顯著低于常規組(P<0.05)；兩組間胚胎著床數、臨床妊娠率及雙胎率均無顯著性差異(P>0.05)(表5)。

2．D5囊胚移植時兩組患者的妊娠結局：D5囊胚移植包括TLI組99例和常規組143例。雖然兩組患者間胚胎著床數、種植率、臨床妊娠率差異均無統計學意義(P>0.05)，TLI組的臨床妊娠率稍高于常規組(表6)。

表4 D3卵裂期移植1枚胚胎時兩組患者的妊娠結局比較[(-±s)，%]

表5 D3卵裂期移植2枚胚胎時兩組患者的妊娠結局比較[(-±s)，%]

表6 兩組患者D5囊胚移植妊娠結局比較[(-±s)，%]

討 論

TLI技術主要是對胚胎的發育過程進行高質量連續的圖像采集，采集圖片頻率為5～10 min，屬于一種非侵入性的評估系統。目前TLI作為一種新的醫學技術，在IVF-ET中被廣泛應用，通過連續性觀察胚胎發育情況，有利于早期篩選出最佳胚胎移植，為胚胎學家提供了更多的動態參考指標[1，9]。準確評估和選擇優質單胚胎移植，降低多胎妊娠率，已成為輔助生殖領域研究的熱點。通過分析胚胎早期動力學參數，可以得出卵裂期胚胎動力學參數預測囊胚形成率及胚胎質量[10]，也可預測胚胎染色體整倍性的潛力。整倍體囊胚的發育速度比非整倍體囊胚更快，在移植的整倍體囊胚中的種植胚胎和非種植胚胎間也有差異[11]。TLI技術結合KIDscore評分，發現4細胞分裂的對稱性與胚胎非整倍性有關，對于預測非整倍性胚胎有一定的參考價值[12]。TLI技術聯合卵丘細胞RNA測序可以更準確的評估胚胎，提高ART的妊娠率[13]，并為以后研究提供方向。許多生殖中心通過TLI技術的胚胎動力參數和形態學構建預測模型對胚胎評分，結合KIDscore預測囊胚移植后的種植率和活產率，發現構建的模型與結果成正相關[14]，可提高卵母細胞利用率并快速高效選擇胚胎。但是該技術的安全性也受到廣泛關注，相比常規組，TLI組的應用是否確定能提高胚胎種植率、改善妊娠結局，尚存在爭議。

王世凱等[15]研究發現TLI組的2PN受精率(71.44%vs. 64.07%)及優胚率(45.21%vs. 41.92%)顯著高于常規組(P<0.05)，但總卵裂率、2PN卵裂率、可用胚胎率、囊胚形成率及優質囊胚率等指標比較均無統計學差異。也有研究發現，TLI組D6優質胚胎數[(0.30±0.61) vs.(0.66±1.01)、臨床妊娠率(49.18% vs.70.42%)和活產率(45.90% vs. 64.79%)均顯著少于常規組(P<0.05)，但兩者新鮮移植和冷凍移植的臨床妊娠率和活產率差異無統計學意義[16]。Wu等[17]的一項前瞻性隨機試驗發現，TLI選擇的D3優質胚胎數顯著低于常規組[(55.8±6.4)% vs.(81.2±4.1)%，P=0.000 5]。本研究中，常規組胚胎的2PN卵裂數、優胚率、卵子成熟率、總受精率均高于TLI培養組(P<0.05)，這與Wu等[17]的研究結果相似，但兩組胚胎的優胚數及囊胚數差異無統計學意義。TLI培養箱需要專用培養皿，配置微滴皿比較繁瑣，耗時較長，部分型號的專業皿，加蓋培養用油容量受限(EDS為1.4 ml)，可能不利于胚胎滲透壓的維持，這可能是導致TLI培養法胚胎的部分數據沒有常規組好的原因之一。

Kalleas等[18]研究發現，與常規培養組相比，使用TLI培養箱的患者活產率更高(43.2% vs. 34.5%)[OR=1.43，95%CI(0.96，2.13)]，早期流產率顯著降低(5.8% vs. 13.8%)[OR=0.37，95%CI(0.19，0.74)]。也有研究表明新鮮胚胎移植中TLI組比常規組有更高的臨床妊娠率和著床率(P<0.05)，但兩組新生兒結局無顯著差異[19]。Meng等[16]研究發現，對于年輕且具有良好卵巢儲備功能的婦女在移植1枚卵裂期胚胎時，常規組的臨床妊娠率和活產率與TLI組無統計學差異(P>0.05)。Mascarenhas等[20]納入了1 882個ART周期，與常規培養組相比，TLI組新鮮移植的活產率更高(36.8% vs. 33.9%，P<0.05)，而冷凍胚胎移植中兩組活產率無顯著差異。本研究中患者行D3卵裂期移植時，常規組的移植胚胎數顯著高于TLI組(P<0.05)，而在進一步根據移植胚胎數分為兩個亞組比較時，兩組間移植1枚D3卵裂期胚胎的著床數及種植率差異雖均無統計學意義(P>0.05)，但是均高于常規組；移植2枚D3卵裂期胚胎的常規組種植率顯著高于TLI組(P<0.05)。

我中心胚胎學家為了降低雙胎率，會根據TLI的動力學參數選擇搭配不同評分的胚胎來選擇移植的胚胎，這可能是TLI組移植雙胚胎時沒有常規組種植率高的原因之一。兩組雙胎率比較雖無統計學差異，但可以看出常規組高于TLI組。

高洋等[21]研究表明，TLI組采用形態學評分結合胚胎動態發育參數選擇的囊胚移植的臨床妊娠率(78.32% vs. 68.66%)和著床率(65.63% vs. 54.83%)均顯著高于常規組(P<0.05)，兩組的流產率比較無顯著性差異(P>0.05)。他們采用的培養法分兩步，胚胎培養至D3暫停圖像，給胚胎換液后繼續放入培養箱。本研究中心胚胎培養至D3時無需更換培養液，減少了換液的干擾，對后期培養囊胚所需環境更穩定。TLI技術彌補了僅通過胚胎形態學評估胚胎的發育的狀態，通過TLI技術可以挑選發育速度較快的胚胎移植獲得可觀的妊娠結局[22]，繼而發揮臨床應用價值。本研究中D5囊胚移植時，兩組間著床數、種植率、臨床妊娠率雖無統計學差異，但TLI組都高于常規組。選擇囊胚移植的患者可以獲得較好的臨床妊娠率。

本研究表明無論移植1枚D3卵裂期胚胎還是D5囊胚胚胎，TLI組的著床數及種植率均高于常規組，進一步說明TLI培養可以改善妊娠結局，減少多胎妊娠的并發癥。也有薈萃分析發現，沒有明確證據表明TLI組和常規培養組在持續妊娠率、臨床妊娠率、著床率上存在統計學差異[23]。

綜上所述，針對年輕不孕的婦女，選擇TLI培養可以提高臨床妊娠率，降低多胎率。目前常規培養方式由于其經濟、簡便，是目前大多數中心的常用培養方法。而TLI技術聯合一步法培養，能挑選出最有潛力著床的胚胎，有效降低多胎率，提高妊娠率，是未來生殖中心發展的方向。然而，本研究樣本量較小，為單中心數據，且大多數患者處于妊娠狀態，未進一步分析新生兒結局，TLI技術對子代健康是否有影響仍需要進行多中心大樣本的臨床研究，進一步證實TLI培養的安全有效性。