慢性子宮內膜炎口服抗生素治療前后的轉錄組測序研究

袁瑩，陳雪梅*，劉容菊，何紅梅，王靜怡，鄒志玲，周麗玲，陳博，李青洋，潘瑞華，蔡昭煒

(1.廣東醫科大學，湛江 524001；2.東莞市松山湖中心醫院生殖中心，東莞 523326)

慢性子宮內膜炎(chronic endometritis，CE)是以子宮內膜間質區漿細胞浸潤為特征的持續性、隱蔽性炎癥疾病。早期認為宮頸粘膜可以提供一個不滲透屏障，阻止細菌從陰道進入子宮，從而維持子宮的無菌環境[1]。但采用細菌培養和宏基因組測序等方法發現子宮內存在大量的微生物，包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)，甚至酵母菌等[2-3]。另外，研究發現抗生素(如多西環素、環丙沙星和甲硝唑等)的使用對CE具有較好的療效[4]。因此，認為CE是由于微生物引起的，但其詳細的誘發機制尚不清楚。

據統計，在育齡婦女中，CE患病率從8%至72%不等[5]。研究發現CE可造成子宮內膜的容受性受損[6]，導致自然妊娠和輔助生殖技術(ART)助孕的受孕率顯著降低[7-8]。經抗生素治療后可顯著改善妊娠結局[9-10]。因此，CE的診斷和治療對于不孕癥極其重要。目前對CE的臨床診斷主要有子宮內膜間質內漿細胞蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組化(IHC)染色。HE染色可以較好地區分具有嗜堿性細胞質的漿細胞，但是與成纖維細胞、單核白細胞、有絲分裂期細胞等較難區分，使得診斷結果受干擾[11]。當B細胞逐漸發育為漿細胞時，細胞表面會表達CD138[12]，因此基于CD138的IHC得以運用。相比HE染色，IHC的CE陽性檢出率顯著升高(56% vs.13%，P<0.01)[13]，但IHC缺乏統一的診斷標準，并且受實驗環境的影響；因此，仍需要進一步尋找更加準確的標記物。

在本研究中，選取采用口服鹽酸多西環素片及甲硝唑片治療后轉陰的25例CE患者，對治療前后的子宮內膜進行轉錄組測序，篩選出差異表達基因，探討抗生素治療CE對子宮內膜基因的影響，基因層面解釋CE治療對恢復子宮內膜功能的作用。

資料和方法

一、研究對象

選取東莞市松山湖中心醫院生殖醫學中心2019年10月至2021年10月期間經一次新鮮或凍融胚胎移植失敗后行子宮內膜活檢診斷為CE的不孕不育患者25例作為研究對象。

納入標準：(1)年齡<40歲；(2)病理診斷患有CE；(3)月經周期25～35 d，自身月經周期變化3 d內。

排除標準：(1)染色體核型異常；(2)自身免疫性疾病。

本研究獲得東莞市松山湖中心醫院醫學倫理委員會批準。所有研究對象均簽署知情同意書。

二、CE診斷與樣本收集

1.CE診斷：采用HE染色及CD138 IHC染色的方法判斷是否患有CE。IHC每高倍鏡視野下至少有1個CD138陽性的漿細胞即診斷為CE[14-16]。

2.標本收集：患者月經干凈3～7 d行宮腔鏡下子宮內膜活檢或直接使用一次性子宮內膜取樣器抽吸子宮內膜，留取2份子宮內膜樣本，其中一份用10%甲醛溶液固定后送病理檢查，另外一份用DNA/RNA保存液于-80℃保存。

如患者病理診斷為CE，保存的樣本進行轉錄組測序(治療前)。診斷為CE的患者于月經期開始口服鹽酸多西環素片100 mg(2次/d)及甲硝唑片400 mg(2次/d)，共服14 d，次月月經干凈3～7 d使用一次性子宮內膜取樣器抽吸子宮內膜，留取2份子宮內膜樣本，保存方法及用途同前。如復查病理診斷無CE，則將子宮內膜樣本進行轉錄組測序(治療后)，如病理診斷仍有CE，則不進行測序，繼續給予相同的抗炎治療，直至復查子宮內膜病理診斷無CE，再將無CE的樣本進行轉錄組測序。

三、50份樣本的建庫與測序

每份樣品用3 μg的總RNA用于建庫測序，建庫方法按照NEBNextUltraTMRNA Library Prep Kit(NEB，美國)的說明書進行。文庫構建完成后，先使用 Qubit2.0 Fluorometer(Life Technologies，美國)進行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng/μl，隨后使用 Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent，美國)對文庫的片段進行檢測，當片段長度符合預期后，qRT-PCR對文庫有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度高于2 nmol/L)，以保證文庫質量。庫檢合格后，利用MGISEQ-2000(華大智造)測序。

四、數據質控與序列比對

使用fastp v 0.19.3 對原始數據(Raw reads)進行過濾，去除N(N表示無法確定堿基信息)的比例>10%的reads；去除低質量reads(質量值SQ≤5的堿基數占整個read長度50%以上的reads)獲得過濾后的數據(clean reads)。使用HISAT v2.1.0構建索引，并將clean reads比對到人類參考基因組(https：//hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/)。

五、差異表達基因篩選

使用FeatureCounts v1.6.2對基因比對情況進行計算，然后根據基因長度計算每個基因的FPKM。采用DESeq2 v1.22.1軟件進行基因表達水平和差異基因篩選，篩選條件設為：Padj<0.05(padj值是校正后的P值，該值越小表示基因表達差異越顯著)且差異倍數的絕對值(|fold change|)>2。

六、差異表達基因的功能富集分析

通過KEGG數據庫對差異表達基因進行功能富集分析，Padj<0.05表示顯著富集。

結 果

一、CE患者的基本情況

25例患者均為經一次新鮮或凍融胚胎移植失敗后行子宮內膜活檢診斷為CE的不孕不育患者。所有患者的年齡為23～38歲，平均年齡(33.48±3.37)歲；體質量指數(BMI)為17.15～26.49 kg/m2，平均BMI(21.56±2.58)kg/m2；不孕年限從1年至11年不等，平均不孕年限(4.76±3.36)年。其中原發性不孕患者占40.0%(10/25)，繼發性不孕患者占60.0%(15/25)。

25例患者中有20例經過1個療程的抗炎治療后復查CE治愈，4例經2個療程治療后復查治愈，剩下的1例經3個療程治愈。1個療程治愈率為80.0%，2個療程治愈率96.0%，3個療程治愈率100%。

25例患者經治療后全部行輔助生殖技術(ART)助孕，經過1～3個周期胚胎移植，平均移植胚胎數1.5個。累計19例臨床妊娠，累計臨床妊娠率79.2%(19/24)；生化妊娠1例，生化妊娠率4.2%(1/24)；未妊娠率16.7%(4/24)；剩余1例尚未移植。

二、轉錄組測序質量控制

為探究口服鹽酸多西環素片與甲硝唑片治療對CE患者子宮內膜基因表達的影響，對25例CE患者治療前和治愈后的子宮內膜(50份樣本)進行轉錄組測序。首先進行測序質量評估，結果詳見表1。每個樣本平均獲得(23.7±1.2)×106條原始數據(raw reads)，對原始數據過濾后得到(23.6±1.2)×106條高質量的測序數據(clean reads)，平均大小為(3.5±0.2) Gb。用Q20與Q30計算 Phred數值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比，其平均值分別為(97.9±0.3)%和(94.4±0.7)%，表示本次測序具有較高的正確率。測序堿基中的GC含量的平均值為(49.6±1.6)%，最大值為55.7%，最小值為42.4%。平均(96.7±1.9)%過濾后的數據能夠比對到人類基因組中，其中(93.3±3.5)%的數據可以比對到基因組的唯一位置。因此，本研究獲得較高質量的測序數據。

表1 轉錄組測序質量評估

三、CE患者抗生素治療前后子宮內膜的基因表達譜

轉錄組測序在50份樣本中共檢測到70 492個轉錄本，分別在不同的樣本中表達。分析每個患者治療前后的差異表達基因，得到差異基因的表達譜(圖1)，每一列表示為一個樣本的基因表達，表達量的高低分別由紅色和藍色表示。根據該結果，不同CE患者個體之間的基因表達具有較大的差異。

四、差異基因的篩選結果

根據篩選標準共篩選出29 510個差異表達基因，其中上調的有11 519個，下調的有17 991個。由于個體間的差異巨大，因此本研究將至少在14例CE患者中表達模式一致的差異基因劃分為顯著差異表達基因，以此為依據，共篩選出38個顯著差異表達基因，其中20個基因在治療后顯著上調表達(P<0.001)，18個基因在治療后顯著下調表達(P<0.001)(表2、圖2)。

圖1 CE患者抗生素治療前后差異基因的表達譜

表2 顯著差異表達的38個基因信息

續表

A：抗生素治療后顯著上調的基因；B：抗生素治療后顯著下調的基因。圖2 口服抗生素治療CE前后的38個顯著差異表達基因的相對表達量

五、差異基因的KEGG分析

對上調和下調表達的29 510個差異基因進行KEGG富集分析，分別得到富集程度最高的前20條通路。其中，上調表達的基因主要富集到與疾病相關的通路，包括神經性多疾病途徑、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、人類乳頭瘤病毒感染、沙門氏菌感染等疾病相關的途徑(圖3A)。而下調表達的基因富集到PI3K-Akt信號途徑、MAPK信號途徑、鞘脂類信號途徑、甲狀腺激素信號途徑等以及一些疾病相關的途徑(圖3B)。上調表達的基因和下調表達的基因共同富集的途徑包括人類乳頭瘤病毒感染途徑、細胞內吞作用、人T細胞白血病病毒1感染途徑、粘著斑途徑、內質網與蛋白加工、溶酶體等生物學途徑。

六、顯著差異基因功能分析

對篩選出的38個顯著差異基因進行功能分析(表3)，其中上調的基因包括細胞周期蛋白D2(CCND2)與類MYB原癌基因2(MYBL2)等調控細胞周期進程的基因，也有免疫相關的凝血因子XIII A(F13A1)基因；在18個顯著下調的基因中，大部分與組織損傷、細胞黏附與轉移、腫瘤發生和細胞免疫相關，例如血漿銅藍蛋白(CP)基因、纖連蛋白1(FN1)基因、金屬肽酶7(MMP7)基因、血小板衍生生長因子受體基因(PDGFRA)和磷蛋白質分泌1基因(SPP1)等。因此，這些顯著差異表達基因可能參與CE的發生過程。

A：上調表達基因；B：下調表達基因。氣泡大小代表富集基因的數量，氣泡越大表示富集基因數越多；顏色代表富集顯著性，越接近紅色表示富集越顯著。圖3 差異表達基因的KEGG分析

表3 顯著差異表達基因的生物學功能描述

續表

討 論

轉錄組測序可以比較直觀全面地呈現器官組織在特定狀態下基因的表達過程，已經廣泛應用于人類生殖疾病方面的研究[17]。CE是發生在子宮內膜上的慢性疾病，通常情況下無癥狀或輕微癥狀。目前認為，CE是由于子宮內的細菌感染引起的，宏基因組學的研究表明大量的微生物存在子宮內，服用抗生素可以有效地治療CE[18]。鹽酸多西環素片與甲硝唑片已經用于CE的臨床研究，但是關于其治療前后子宮內膜的基因表達并沒有報道。

本研究中首先用口服鹽酸多西環素片與甲硝唑片治療CE患者，并對治療前和治療后轉陰的子宮內膜進行轉錄組測序。結果表明，大量與疾病相關的基因在治療前與治療后差異表達(圖1和圖2)。尤其一些治療后下調表達的基因被富集到不同的炎癥相關信號途徑：(1)PI3K-Akt信號途徑。PI3K-Akt途徑一般參與氧化應激和炎癥反應的調節，Nrf2是其下游的關鍵因子。有研究表明PI3K-Akt途徑可激活Nrf2且在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中發揮重要作用[19]；(2)MAPK信號通路。MAPK信號通路是介導細胞外信號到細胞內信號的重要信號轉導途徑之一，可調節細胞增值、遷移、炎癥、凋亡等多種病理生理過程，一些研究報道稱，藥物治療可通過MAPK信號途徑減輕炎癥反應，例如當歸多糖通過MAPK信號通路減輕LPS誘導的真皮細胞炎癥反應[20]；(3)鞘脂類信號途徑。在哺乳動物中，鞘脂信號途徑是指鞘脂水解產物神經酰胺(Cer)和鞘脂苷-1-磷酸(S1P)在多種細胞信號通路中發揮作用的過程[21]。多項研究表明，這些鞘脂介質，包括神經酰胺、神經酰胺-1-磷酸和S1P，可能在炎癥中起著不可或缺的作用，并且有望成為新的治療靶點。本研究結果中差異基因的KEGG分析提示，上述信號通路可能參與CE的發生。

在鑒定的差異表達基因中，根據至少在14例CE患者中表達模式一致原則，最終篩選到38個顯著差異表達基因。上調的基因有轉錄因子，例如編碼鋅指蛋白的JAZF1，ETS家族的SPDEF以及編碼MYB家族轉錄因子的MYBL2。有與癌癥相關的基因，如編碼癌癥抑制因子的H19以及在人類癌癥中經常活躍表達的IGFBP5等。另外還有一些與免疫相關的基因如F13A1，該基因編碼的蛋白參與傷口愈合、免疫系統功能、維持妊娠、骨形成和新血管生長等方面。在這些治療后上調的基因中，值得關注的是RASD1基因和OVGP1基因。CE患者通常會導致自然妊娠和ART助孕的受孕率顯著降低。有研究報道，反復種植失敗(RIF)患者表現為子宮內膜Ras信號通路的基因表達異常，且RASD1的表達水平顯著降低。而在正常情況下，RASD1充當信號因子調節宮腔環境而促使胚胎著床成功[22]。OVGP1由子宮內膜上皮表達，胚胎植入時在管腔上皮細胞中被特異性誘導，它可調節子宮內膜容受性相關基因并幫助滋養層粘附[23]。Laheri等[24]發現RIF的女性子宮內膜中OVGP1顯著降低。因此RASD1及OVGP1的表達水平有望成為CE治療后是否恢復受孕能力的一個檢測指標。在CE治療后下調表達的基因中，炎癥相關的基因如GPX3、NTN4和MMP7等均顯著下調。GPX3編碼的谷胱甘肽過氧化物酶可以催化過氧化物轉化為水，研究表明GPX3參與?；悄懰峥寡追磻猍25]。NTN4編碼一種與層粘蛋白相關的分泌蛋白和導向分子，存在于血管基膜中，研究發現這種分泌蛋白可提供一個對抗炎癥的保護環境，阻止細胞因子的產生[26]。這些炎癥相關因子的下調表達表明其炎癥反應已經減輕。MMP家族基因通常在成年人的組織器官中低水平表達，然而當發生組織修復、炎癥反應以及胚胎發育過程中，其表達量會顯著上調[27]。根據以往的文獻證據，我們推測CE抗生素治療后炎癥消退，MMP7的表達會隨之下調。本研究中轉錄組測序結果顯示抗生素治療后的CE患者中MMP7顯著下調，與先前的文獻報道一致[24]。

本研究選取的研究對象為同一人群CE抗生素治療前后的子宮內膜樣本，可以最大程度地減少不同個體間的基因表達差異，但也有一定的局限性：由于未設置對照組，無法比較CE患者治療前后與正常未患病人群的基因差異表達；另外，由于本研究用口服鹽酸多西環素片和甲硝唑片治療CE，不排除相關的基因表達差異存在藥物特異性，服用不同藥物治療后基因差異表達譜可能不同。

綜上所述，本研究利用轉錄組測序技術對口服抗生素治療CE患者的子宮內膜基因表達進行分析。結果表明PI3K-Akt信號途徑、MAPK信號途徑與鞘脂信號途徑可能參與了CE炎癥反應過程。與治療前相比，參與Ras信號通路的RASD1基因的表達水平在治療后顯著提高，它能夠調節宮腔環境而促使胚胎著床成功。另外，一些抗炎相關因子基因GPX3、MMP7和NTN4的表達量均顯著下調，表明其炎癥反應已經減輕。

本研究可以對CE的治療提供一定的臨床依據，也為研究CE的發病機理提供一定的前期基礎。在接下來的研究中需要進一步擴大樣本量及完善空白對照組的基因測序及分析，并且對一些關鍵基因進行RT-qPCR驗證，以進一步探索轉錄組測序在CE診治中的臨床價值。