多囊卵巢綜合征患者顆粒細胞蛋白質組學分析

焦蕓云，宋寧，王苑，方星瑜，宋文妍

(鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心，鄭州 450052)

多囊卵巢綜合征(PCOS) 是育齡期女性常見的生殖與代謝性疾病，其主要的臨床特征包括促性腺激素分泌失調、高雄激素血癥、胰島素抵抗和卵泡發育不良等[1]。雖然輔助生殖技術已成為PCOS排卵障礙性不孕癥的常用治療方法，但由于PCOS患者內分泌紊亂和代謝失調導致的卵泡發育異常，在接受IVF/ICSI治療時常出現卵母細胞成熟度低和卵母細胞質量差的問題[2]。同時，PCOS女性發生流產、早產等不良妊娠結局及2型糖尿病、子宮內膜癌等疾病的風險也顯著高于正常人群[3]。因此，深入研究PCOS發生的分子機制，具有重要的臨床和社會價值。

顆粒細胞圍繞于卵母細胞周圍，通過縫隙連接、旁分泌等多種方式與卵母細胞相互作用。顆粒細胞分泌的蛋白質、類固醇和多糖等物質是卵泡液的重要成分，為卵母細胞的生長發育提供了適宜的微環境。先前關于PCOS的蛋白質組學研究大多集中于血清和卵泡液，Insenser等[4]認為，研究PCOS患者顆粒細胞中的蛋白質表達變化或許可以幫助我們更清楚地了解PCOS的發病機制。因此，我們進行了蛋白質組學分析，鑒定PCOS患者顆粒細胞中的差異表達蛋白，初步分析差異蛋白在PCOS發生中的作用。

材料與方法

一、研究對象

選擇2020年9月至2021年9月于我院生殖醫學中心行IVF/ICSI助孕的患者共24例，其中PCOS組12例和正常排卵對照組12例，收集取卵后廢棄卵泡液并提取顆粒細胞。

PCOS的診斷參照2003年鹿特丹診斷標準。

對照組為因輸卵管因素或男方因素不孕的非PCOS女性。納入標準：月經周期規律，基礎體溫雙相；超聲檢查卵巢無多囊樣改變；基礎內分泌正常。

兩組排除標準：子宮內膜異位癥；卵巢功能減退及卵巢發育不良；其他導致排卵障礙的全身性疾病，如高泌乳素血癥、甲狀腺疾病、Cushing 綜合征等；染色體異常。

本研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準(倫理審查編號：2022-KY-0157-002)。所有患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.顆粒細胞提取：收集取卵日卵泡穿刺液，根據已發表文獻所述方法[5]，采用密度梯度法分離卵泡液中顆粒細胞。將卵泡液于室溫下以1 500 r/m離心15 min，棄上清，用預熱的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)重懸細胞沉淀。將細胞懸液以1∶1的比例緩慢加到人外周血淋巴細胞分離液(北京索萊寶)頂部，室溫下以2 000 r/m離心20 min。離心后管中液體從上至下分為3層，小心吸取中間白色霧狀層至新的離心管中。用預熱的培養基洗滌顆粒細胞2次，將其放入37℃、5%CO2培養箱中培養2 d以去除混雜的血細胞。

2.液相色譜-串聯質譜分析：每組各取3例顆粒細胞樣本，提取蛋白，使用BCA試劑盒(北京索萊寶)測定蛋白濃度。對蛋白質進行胰蛋白酶酶解，除鹽后真空干燥。采用TMT標記試劑盒(Thermo，美國)對肽段進行6重TMT標記，然后通過高效液相色譜系統進行分離。緩沖液A為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液，緩沖液B為含0.1%甲酸和80%乙腈的水溶液。將樣品以300 μl/min 的流速上樣到C18分析柱(Agilent，美國)上進行梯度洗脫。緩沖液梯度設置：0～55 min，8% B；55～79 min，30% B；79～80 min，50% B；80～90 min，100% B。采用Q Exactiv質譜儀(Thermo，美國)進行質譜分析。以70 000的分辨率進行一級質譜掃描，質譜全掃描范圍為300～1 600 m/z。選擇其中10個最高峰對肽段母離子進行二級質譜掃描。自動增益值設置為2E5，離子最大累積時間為80 ms，動態排除時間設為15 s。

3.蛋白質鑒定與生物信息學分析：采用Proteome Discoverer 2.2 軟件在Uniprot人類數據庫中對質譜原始數據進行檢索，并對檢索結果進行統計學分析。差異蛋白的篩選標準：①差異倍數>1.2 或<0.83；②P<0.05。為了進一步探索差異蛋白的生物學功能，我們采用OmicsBean組學數據分析系統，對差異蛋白進行了基因本體(GO)功能注釋分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路注釋分析，采用Cytoscape軟件在STRING數據庫中進行蛋白質相互作用(PPI)分析。

4.Western Blot：另取PCOS組和對照組各9例樣品，每組中的3例隨機混合，形成3組生物學重復；從差異蛋白中隨機選取4個蛋白(LDHA、YY1、AFP和LZTS1)，采用Western Blot法對蛋白質譜結果進行驗證。步驟如下：將蛋白質樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移到PVDF膜上，與5%的脫脂牛奶共同孵育1 h；將PVDF膜分別與鼠抗LDHA(ab112996；Abcam，英國)、兔抗YY1(ab109228；Abcam，英國)、兔抗AFP(WL03819；沈陽萬類)、兔抗LZTS1(ab226335；Abcam，英國)及鼠抗α-Tubulin(11224-1-AP；武漢三鷹)一抗(均為1∶1 000稀釋)在4°C孵育過夜；用TBST(含Tween 20 的鹽酸緩沖液)清洗PVDF膜3次后，加入HPR標記山羊抗兔及山羊抗鼠二抗(武漢三鷹)，在室溫下孵育1 h；再次清洗PVDF膜3次，使用增強型化學發光檢測試劑盒(Affinity，美國)進行顯影，并通過Image Lab(6.1)軟件進行定量。

三、統計學分析

對每組各個標本的蛋白質譜原始定量值進行log 2轉換，使數據滿足正態分布。使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，采用t檢驗對定量數據進行組間比較，以P<0.05為具有統計學意義。

結 果

一、患者基本臨床特征

本研究共納入PCOS患者(PCOS組)和正常排卵的非PCOS患者(對照組)各12例。兩組間抗苗勒管激素(AMH)水平、基礎LH水平及基礎LH/FSH比值均顯著高于對照組(P<0.05)，Gn總劑量顯著低于對照組(P<0.05)；其余臨床資料無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 PCOS組和對照組基本臨床資料(-±s)

二、 蛋白質鑒定與生物信息學分析

通過在Uniprot人類數據庫中對質譜原始數據進行檢索，并對檢索結果進行統計學分析。結果顯示，PCOS組表達上調的蛋白共169個，包括SERBP1和VDBP等；下調蛋白160個，包括PDH、ENO1、PGAM1、PFKP、PDHX、LDHA、CPPED1、SFGH、GST和LZTS1等。表2和表3分別列出了前20個上調蛋白和下調蛋白。

表2 差異倍數排名前20的上調蛋白

續表

表3 差異倍數排名前20的下調蛋白

GO注釋分析結果表明(圖1)，這些差異表達的蛋白質主要參與化學響應、脅迫響應和細胞激活等生物過程；主要參與的細胞組成為胞外囊泡、胞外外泌體和胞外空間等；主要的分子功能為蛋白結合、poly(A) RNA結合和蛋白同源二聚體活性等。

圖1 差異表達蛋白GO富集分析柱狀圖

對差異蛋白進行KEGG富集分析，圖2展示了前20條顯著富集的生物學通路，包括纈氨酸、亮氨酸、和異亮氨酸分解，丙酮酸代謝，糖酵解/糖異生，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，脂肪酸代謝，谷胱甘肽代謝，補體和凝血級聯反應等。表4列出了顯著性排名前10的KEGG通路及參與該通路的差異蛋白。PPI分析結果展示了差異蛋白間的相互作用網絡(圖 3)。本研究的蛋白質譜原始數據已上傳至ProteomeXchange數據庫，可從通訊作者處獲得。

圖2 差異表達蛋白KEGG信號通路富集分析氣泡圖

表4 差異蛋白參與的顯著性排名前10的生物學通路

圖3 差異表達蛋白的相互作用網絡

三、差異蛋白表達水平驗證

Western Blot結果(圖4)顯示，PCOS組中的下調蛋白LDHA和LZTS1的表達水平顯著低于對照組(P<0.05)，而上調蛋白YY1和AFP的表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，與蛋白質組學的結果一致。

A：LDHA；B：YY1；C：AFP；D：LZTS1；與對照組比較，*P<0.05。圖4 Western Blot檢測兩組患者LDHA、YY1、AFP和LZTS1蛋白表達水平

討 論

本研究對PCOS患者卵巢顆粒細胞進行了蛋白組學分析。KEGG分析結果表明，差異蛋白在多條代謝相關的生物學通路中顯著富集，如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸分解，糖酵解/糖異生，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，脂肪酸代謝等。多種參與糖酵解/糖異生過程的酶如PGK1、PGK2、ENO1、PGAM1、PFKP、PDHX和LDHA在PCOS組中顯著下調。卵母細胞對葡萄糖的利用能力差，卵泡生長所需的能量主要由顆粒細胞通過糖酵解提供[6]，糖酵解過程異常可導致顆粒細胞供能不足，影響卵泡生長及卵母細胞成熟。支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)不僅是人體必需的能源物質，還可作為信號分子調節糖脂代謝[7]。先前的研究表明，支鏈氨基酸代謝異常與肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發生密切相關，血清支鏈氨基酸水平可影響PCOS胰島素抵抗的發生和進展[8]。人體無法合成支鏈氨基酸，只能從外界攝取，所以體內支鏈氨基酸平衡的維持主要依靠其分解代謝。PCOS顆粒細胞內支鏈氨基酸代謝異常，不僅影響卵泡中蛋白質的合成，還可影響葡萄糖和脂肪酸代謝，干擾卵泡微環境中的代謝穩態。綜上所述，本研究的結果表明PCOS顆粒細胞內存在葡萄糖、脂肪酸及多種氨基酸的代謝紊亂，推測這些代謝異常可造成卵巢環境的改變，進而影響卵泡發育和卵母細胞成熟。

本研究顯示，與對照組比較，PCOS組中鈣調樣磷酸酯酶結構域包含蛋白1(CPPED1)表達下調。在PI3K/AKT信號通路中，Ser473的磷酸化對于AKT1的激活是必不可少的，而 CPPED1可使Ser473去磷酸化，導致AKT1激活受阻[9]。研究發現，在成熟脂肪細胞中敲低CPPED1可促進胰島素刺激的葡萄糖攝取，并上調參與葡萄糖代謝基因的表達水平[10]。我們推測，PCOS患者顆粒細胞中CPPED1表達下調或許可能干擾PI3K/AKT的信號傳導，影響葡萄糖代謝。有研究者發現，與選擇性剖腹產相比，自然分娩中胎盤CPPED1 mRNA表達量顯著降低，但兩組AKT1的磷酸化水平并無差異[11]，提示CPPED1可能具有不同的功能。深入探索CPPED1在PCOS發病中的作用，或許可為PCOS發病機制的研究提供新的方向。

本研究發現PCOS組SERBP1蛋白的表達明顯增加。SERBP1是纖溶酶原激活物抑制劑1 RNA結合蛋白，表達于顆粒細胞的細胞膜和細胞質中。在卵泡發育過程中，孕酮通過與孕酮膜受體(PGRMC1)結合，抑制顆粒細胞的有絲分裂和凋亡[12]。研究發現SERBP1可作用于PGRMC1，調節孕酮對顆粒細胞的作用，敲除SERBP1后，孕酮抗顆粒細胞凋亡的能力明顯減弱[13]。國外有學者發現，與排卵規律的女性相比，PCOS女性卵巢顆粒細胞的凋亡率顯著降低[14]。我們推測，PCOS中SERBP1的高表達或許可減少顆粒細胞的凋亡。顆粒細胞的增殖、分化和凋亡，伴隨著卵泡的發育、成熟和閉鎖，研究者認為卵泡閉鎖減少導致卵泡積聚可能是PCOS發病機制之一[15]。因此進一步研究SERBP1在PCOS卵泡發育中的功能，或許可為PCOS發病機制的闡明提供幫助。

本研究中KEGG分析顯示，差異蛋白在谷胱甘肽代謝途徑中顯著富集，涉及的蛋白如S-甲酰谷胱甘肽水解酶(SFGH)和谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等，在PCOS組顯著下調。SFGH催化S-甲酰谷胱甘肽轉化為谷胱甘肽(GSH)，在GSH的生物合成中發揮重要作用。GST催化GSH與親電子化合物結合，是體內活性氧(ROS)代謝系統的重要成員。卵泡的生長伴隨著活躍的物質代謝，隨著卵泡的發育，其對能量的需求逐漸增加，ROS的產生也隨之增多。谷胱甘肽代謝系統異常可導致卵泡中的活性氧不能被有效清除，使細胞遭受氧化應激(OS)的損害。研究發現，OS參與PCOS發病的多個方面，包括排卵障礙、胰島素抵抗(IR)和高雄激素血癥等[16]。PCOS患者卵泡液中ROS的蓄積可抑制卵母細胞減數分裂過程中紡錘體的形成，導致卵母細胞減數分裂停滯[17]。從谷胱甘肽代謝途徑入手，或許可為PCOS的治療提供新的思路。

維生素D結合蛋白(VDBP)是一種多功能球蛋白，其主要功能是與維生素D及其代謝產物結合，調節維生素D的分布和代謝。循環中大部分維生素D都以與VDBP結合的形式存在，僅少部分為具有生物學活性的游離維生素D，VDBP水平的變化，可影響維生素D的結合狀態和游離維生素D的水平。我們的結果顯示，PCOS組顆粒細胞中VDBP的表達水平明顯高于對照組。同時有研究者發現，PCOS患者尿液中VDBP的表達水平也顯著高于正常人群[18]。PCOS患者中普遍存在維生素D缺乏，但其發生機制目前尚不清楚，我們推測VDBP表達水平的改變或許與維生素D缺乏有關。此外，VDBP可轉化為一種強效巨噬細胞活化因子，在炎癥反應中激活巨噬細胞，并增強C5a對巨噬細胞、中性粒細胞等免疫活性細胞的趨化作用[19]。PCOS被認為是一種慢性低度炎癥性疾病，研究發現PCOS患者的卵巢組織中淋巴細胞和巨噬細胞的數目明顯增加，炎癥信號通路異常激活，導致排卵障礙[20]。顆粒細胞VDBP的異常表達或許參與了PCOS卵巢局部的炎癥反應。

我們發現亮氨酸拉鏈腫瘤抑制因子1(LZTS1)在PCOS患者中的表達水平明顯降低。LZTS1調節細胞分裂M期細胞周期蛋白依賴性激酶1(Cdk1)的活性，LZTS1的缺失可導致有絲分裂時間縮短，染色體分離發生錯誤[21]。因此LZTS1可影響細胞增殖和腫瘤生長，在多種人類腫瘤中都發現了LZTS1的表達下調[22]。Miura等[23]將胎鼠卵巢移植到雄性宿主體內，發現LZTS1的表達在移植后7～10 d 降低，而一些睪丸相關基因表達增加，進一步研究發現是由雄性宿主的睪酮所介導。因此我們推斷LZTS1的表達下調或許與PCOS高雄激素血癥有關，進而影響顆粒細胞的增殖導致PCOS卵泡發育異常。

在這項研究中，我們分析了PCOS患者顆粒細胞的蛋白質表達譜，共鑒定出329個差異表達蛋白。差異蛋白參與葡萄糖、脂質及氨基酸代謝等多種生物學通路，我們發現其中一些差異蛋白可能涉及顆粒細胞凋亡、活性氧代謝和卵巢炎癥反應等過程。未來進一步探索這些差異蛋白的功能或許可為PCOS發病機制的研究提供更多線索。