提高釀酒酵母耐受性能的研究進展

馬吉喆，李镕濤，陸筑鳳，李加友*，徐濤*

1. 浙江理工大學生命科學與醫藥學院（杭州 310018）；2. 嘉興學院生物與化學工程學院（嘉興 314001）

乙醇（酒精）是重要的大宗化學品，在化學工業、醫藥衛生、食品和農業等方面都有非常廣泛的用途。2020年全球利用酵母發酵生產的乙醇達990億 L，其中美國的產量占54%，巴西占30%[1]*，而我國的產量為92億 L，約占10%。面對復雜多變的國際局勢造成的能源危機和使用化石燃料帶來的嚴重環境問題，作為最具潛力的可再生能源生產方式，利用淀粉和木質纖維為原料發酵生產乙醇的技術研究深受學術界和產業界的關注，燃料乙醇是可再生能源中替代石油的最優選擇[2]*。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是發酵生產燃料乙醇的最重要微生物，因為釀酒酵母的生長速度快，對糖的轉化利用率高，并且人類對其開發利用的歷史悠久，對其生物學特性已有充分了解[3-5]*。但是，釀酒酵母對高體積分數乙醇較為敏感，工業化的發酵體系中乙醇體積分數通常不能超過14%，被認為是燃料乙醇生產成本過高的最主要原因，這嚴重制約了燃料乙醇的商業化發展[6-8]*。

深入研究釀酒酵母對乙醇等脅迫條件的耐受機理，建立高效的應對措施是學術界和產業界共同關注的課題。基于此，對近年來在釀酒酵母的乙醇耐受、高溫耐受和高滲耐受機制研究進行總結，并綜合分析提高釀酒酵母應對各種脅迫的技術方案，為行業共同解決高體積分數乙醇發酵提供思路。

1 釀酒酵母的耐受機制

1.1 釀酒酵母的醇類耐受機制

乙醇作為釀酒酵母的主要代謝產物，雖然釀酒酵母對乙醇具有較高的耐受性[6]*，但仍對乙醇的毒性作用很敏感。隨著發酵時間延長，乙醇體積分數升高，進而對酵母的生長產生抑制作用。酵母在發酵過程中能通過調節代謝來保證自身的正常生長，即產生乙醇耐受性。酵母的乙醇耐受性能取決于很多方面，其中酵母細胞結構和自身遺傳基因對其耐受性起著關鍵作用[8]*，主要包括熱激蛋白合成基因、海藻糖合成酶基因[9]*及脯氨酸、精氨酸和色氨酸的tRNA基因tR（ACG）D和亮氨酸tRNA基因tL（CAA）K[10-11]*。HSP編碼基因可在乙醇的促使下合成特定的熱激蛋白，能起到穩定細胞膜和蛋白質的作用，通過應激反應減弱乙醇對細胞的毒害作用，從而提高釀酒酵母乙醇耐受性[12]*。乙醇體積分數升高時，這些基因會被激活合成相關蛋白和海藻糖，增強酵母對乙醇的抵抗能力；其中海藻糖和脯氨酸可以防止蛋白質變性、減少膜的滲透性改變，海藻糖是細胞在環境脅迫下的應激產物；脯氨酸是一種滲透保護物質，可保護和維持生物大分子物質在脅迫環境下的穩定性，被認為是酵母對脅迫因素耐受性的重要指標[13]*。丁醇異構體對酵母細胞的毒性要比乙醇大得多，通過增加熱休克蛋白70、敲除關鍵基因可以增加異丁醇耐受性[14]*；其中參與蛋白質降解的基因對細胞耐受丁醇異構體很重要，但和耐受乙醇的能力不相關[15]*。

1.2 釀酒酵母的高溫耐受機制

溫度作為影響酵母菌生長的重要因素，會影響酵母菌的酶活性以及對營養物質的吸收和利用，而不同的酵母菌對溫度的耐受性也不同[16]*。邊明鴻等[17]*從發酵的桑葚果酒中篩選的異常威克漢遜酵母可在36 ℃的高溫環境下生長。酵母菌的耐熱機制涉及多個生理過程的變化，其中誘導表達熱激蛋白的過程起主導作用[18]*，細胞內熱激蛋白基因HSP104的大量表達可以提高酵母的耐熱性[19]*；在耐熱性很差的刀豆（HSP101缺陷型）中導入酵母HSP104基因并使之正常表達，刀豆的耐熱缺陷很快就得到彌補并恢復正常[20]*。海藻糖對提高溫度耐受性也有顯著作用[21]*。

1.3 釀酒酵母的高滲耐受機制

高體積分數乙醇發酵所面臨的主要挑戰就在于酵母對滲透壓的耐受能力，酵母菌對滲透壓的脅迫存在多種調節途徑，如高滲透壓甘油（HOG）途徑和Yap1/skn7介導的途徑分別專門參與對滲透性和氧化應激的反應。HOG-MAPK途徑和耐高滲有密切關系，其調控機制主要在于通過信號傳遞激活3-磷酸甘油脫氫酶基因（gpd1、gpd2等），促使滲透物甘油等的合成，從而改變細胞的滲透勢來提高酵母耐高滲能力[22]*。除此之外，海藻糖的合成對酵母耐高滲也有一定影響，不同發酵底物使得異常威克漢遜酵母對糖的耐受性不同，并從自然發酵果蔬酵素中分離得到耐高糖能力的異常威克漢遜酵母，這為耐高滲發酵劑的使用提供實踐經驗[23]*。另外，Elp3基因影響釀酒酵母的咖啡因耐受性，其和耐高滲性能方面也有密切關系[24]*。

2 提高釀酒酵母耐受性的方法

在乙醇發酵過程中，以生產效益為導向的過程管理中會迫使釀酒酵母處于嚴重的不平衡狀態，即高溫、高滲透、高底物濃度和高乙醇體積分數等環境因子的脅迫，對釀酒酵母的生長和代謝產生嚴重影響。因此，高性能生產菌株和高水平工藝控制的根本目標就是提高酵母的耐受性，使其在特殊環境中也能維持正常的生長和代謝。關于提高釀酒酵母耐受性的方法有很多，如菌種改良、培養基優化、添加輔助因子等均取得一定進展。

2.1 菌種改良提高酵母耐受性的方法

菌種改良方法包括自然選育、傳統誘變育種和現代基因工程。自然選育是產業界較為常用的方法[25]*。而誘變育種可以提高突變頻率和變異譜，更容易獲得高產菌株。溴化乙錠是常用誘變劑，利用溴化乙錠誘變篩選出呼吸鏈缺陷型酵母菌株，在42 ℃高溫下維持較高的生長能力和發酵能力，與對照菌株相比乙醇產量高出2倍[26]*。但是誘發突變的隨機性比較大，要進行大規模的篩選工作才能獲得良好效果，且變異菌株不穩定，易出現回復突變。現代基因工程是通過基因組改造技術來實現對菌種改良，如全局轉錄因子工程[27]*、基因組多重位點自動改造技術[28]*等，這些方法可在短時間里獲得優良的菌種，是已報道最先進的微生物育種技術。在gln3D酵母菌株中刪除GLN3，增強工程菌株的耐受性，并使異丁醇產量提高4.9倍[29]*。王灝等[30]*通過基因組改組技術對釀酒酵母進行2次改造后，得到耐熱和發酵性能較好的菌株，使其可在35℃條件下有較高的乙醇產量；也可通過表達GLN1基因，提高釀酒酵母的谷胱甘肽含量，使其對糠醛的耐受性得到提高，乙醇產量也提高了5.3倍[31]*。當然，控制釀酒酵母耐受性的調控基因數量達幾百個，涉及很多亞細胞結構的變化，很難確定在提高酵母耐受的同時，不影響其他發酵性能。利用基因組改造和適應性進化篩選獲得的釀酒酵母菌株S.C D 12，工業小試發現其在35 ℃高溫下仍能保持良好的乙醇產量和較低的殘糖，適合于工業化生產，能極大節約工業上冷卻水的使用，降低發酵成本[32]*。也可以通過HAA1蛋白的過表達，提高釀酒酵母的乙酸耐受性[33]*。由pntAB編碼的7個大腸桿菌反應，edd、pfl、pps、maeD、ppc和mdh作為胞質反應添加到釀酒酵母的骨架代謝模型中，能彌補結構差異，改善了釀酒酵母的生產力[34]*。在產乙醇的大腸桿菌KO11菌株中過表達isc系統，可以提高乙醇耐受性和ADH活性，以及將醋酸合成的代謝通量轉向乙醇以提高乙醇產量[35]*。

2.2 優化培養基提高酵母耐受性的方法

在工業發酵的生產中，培養基既是釀酒酵母的生存環境，也是其營養物質的主要來源，能夠直接影響酵母的生長和代謝。發酵培養基的設計和優化在整個工業發酵中有著舉足輕重的地位。通過對原有培養基成分進行配比和不同的試驗設計方法，實現釀酒酵母對不同脅迫因素的耐受性增加，進而實現發酵產物的提高。在秸稈發酵乙醇的研究中發現，里氏木霉（Trichoderma reesei）T12菌株產纖維素酶活力提高115%，秸稈被轉化為乙醇的量得到提升[36]*。在酵母發酵過程中，向培養基中添加磷酸二氫鉀、硫酸鎂和尿素，乙醇產量提升20 g/L，達到原本最高產量的119%[37]*。優化培養條件，可以提高酵母生物量[38]*，更會對乙醇代謝起到促進作用，達到事半功倍的效果[39]*。褚金磊等[40]*通過響應面法優化最適培養基在該培養基條件下發酵12 h，胞內巰基含量最高可達1.82%，比未優化前提高60%，使得釀酒酵母的抗氧化性提高、乙醇產量增加，為后期進行高密度工業化發酵奠定基礎。

2.3 添加輔助因子提高酵母耐受性的方法

通過在發酵過程中添加相關的輔助因子既能夠促進酵母生長、增強代謝、彌補酵母營養缺失的物質，如表面活性劑、發酵助劑及一些金屬離子，還可以增強酵母對乙醇的耐受性，從而增加乙醇產量。可通過添加鉀離子或緩沖液來限制培養基的酸化，增加酵母對乙醇的耐受性，提高乙醇滴度進而增加乙醇的耐屬性提高酒精產量[41]*。也可以添加鋅提高酵母細胞對乙醇、高溫和乙酸的耐受性[42]*，在0.1 mm Zn2+*條件下酵母菌達到最大的活力、生物量和乙醇產量[43]*。在石榴酒發酵中添加發酵助劑VVR（主要含硫酸銨鹽和無機鹽）可以提高發酵速率和乙醇產量[44]*；法國LALLEMAND生產的發酵助劑（含酸性物質）在山葡萄酒的發酵中可以提高糖的利用率[45]*。楊昳津等[46]*通過添加外源物觀察酵母Et20的耐受性，得出硬脂酸能最大限度提高釀酒酵母菌株Et20的乙醇耐受性，促進酵母Et20在乙醇脅迫下的生長，又提高酵母Et20的發酵強度。超高體積分數（VHG）乙醇發酵過程添加乙醛，發酵結束的乙醇體積分數達17%（對照的乙醇濃度為7%）[47]*。惠繼星等[48]*總結表明乙醛由酵母通過代謝途徑產生，作為代謝的一個節點，乙醛既能還原成乙醇又能氧化成乙酸。將酒糟多肽作為天然產物添加到糖蜜培養基中可以促進酵母的生長代謝和發酵性能，而且有助于酵母抵抗高滲透壓和乙醇體積分數[49]*，添加0.5%大豆肽能有效促進酵母生長，增加抗逆性并提髙發酵速率[50]*。在發酵體系中添加不同體積分數的乙偶姻能夠促進碳源更多地分配給2, 3-BD的合成途徑，從而增加乙醇產量[51]*。通過低強度的超聲處理，也可在不改變釀酒酵母耐受性的前提下使得釀酒酵母的生物量增加127.03%[52]*。

3 結語與展望

燃料乙醇可替代化石能源，有利于綠色發展，符合國家安全需要；充分利用農林廢棄物為原料，可以助力解決“三農”問題。近年來，我國燃料乙醇產業發展取得長足進步，但是相比于美國、巴西等國家，中國仍面臨原材料供應不穩定、產業鏈不完整、競爭平臺不公平等問題，嚴重阻礙燃料乙醇的發展進度[53]*。

從技術開發和生產管理角度來看，發酵工藝和菌種問題是整個產業的核心所在。工藝方面主要在于提高發酵溫度從而減少冷凝水的使用；乙醇發酵工業在降本增效問題上，更加關注對菌株的耐受性改造。通過了解釀酒酵母的生長代謝和耐受機制，通過過表達某些基因增釀酒酵母對特異性耐受性，通過對優良菌種的篩選獲得最大效益的菌株進行培育，除以之外通過改良培養基的營養成分和插入重組質粒誘導育種出高抗逆性酵母菌株，將作為研究的主流方向。隨著科技的進步，對酵母耐受性能的研究技術也會不斷突破，更多優秀的品種有望應運而生，并在工業生產中實現大規模應用，發展前景十分廣闊。