QuEChERS-液相色譜-串聯質譜法測定谷物中噻霉酮殘留

葉慧娟*，黃象金，楊建濤

肇慶市食品檢驗所（肇慶 526040）

噻霉酮（benziothiazolinone）化學名稱為1, 2-苯并異噻唑啉-3-酮，是一種由我國獨立研發的新型噻唑類有機雜環類殺菌劑，具有內吸性能好、傳導性強、劑型先進、低毒和安全等特點，被廣泛應用于農作物細菌性和真菌性病害的預防和治療，可有效防治黃瓜霜霉病、梨黑星病、蘋果瘡痂病、柑橘炭疽病、葡萄黑痘病等[1-3]*。但過量使用會導致食品中殘留噻霉酮，危害人體健康。已報道的噻霉酮殘留檢測方法主要是液相色譜法。于福利等[4]*對黃瓜和土壤分別用丙酮和二氯甲烷提取，經固相萃取凈化，液相色譜法測定噻霉酮的最低檢出質量分數是0.01 mg/kg。趙子丹等[5]*對小麥及土壤分別用丙酮和乙腈提取，液相色譜法測定噻霉酮的最低檢測質量分數是4.0×10-3*mg/kg。陳國珍等[3]*通過高效液相色譜-紫外-可見分光光度法對制劑中的噻霉酮有效成分進行定量分析，噻霉酮的最低檢出量為2.5×106*g。但液相色譜法的靈敏度低、選擇性差，而且為了排除雜質峰的干擾，樣品預處理耗時復雜，有機溶劑成本高、毒性大。因此，開發快速、簡單、科學、準確的噻霉酮檢測技術具有廣闊的應用前景。

QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）是一種快速的樣品前處理技術，具有安全、回收率高、分析速度快等特點，被廣泛使用于農產品和食品中農藥殘留的檢測分析[6-14]*。已報道僅有粟有志等[6]*采用改良的QuEChERS方法測定果蔬中及其制品中噻霉酮殘留，尚缺乏谷物中噻霉酮殘留分析方法的報道。試驗采用QuEChERS技術提取谷物中的噻霉酮，建立液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）測定谷物中噻霉酮殘留的方法。國內關于食品中噻霉酮殘留的檢測方法還沒有相應的國家及部頒標準，國外也未見報道，因此對國家標準或行業標準中噻霉酮的分析檢測具有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

噻霉酮標準物質（純度＞99%，Fiut standand公司）；C18、乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA，美國Aglient公司）；氯化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純，廣州化學試劑廠）；乙腈（質譜級，德國Merck公司）。

1.2 儀器與設備

Acquity H-class/X evo TQD超高效液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀（沃特世公司）；Fotector p氮吹儀（美國Reeko公司）；UMV-3多管漩渦混合器（北京優晟聯合科技有限公司）；高速臺式冷凍離心機H1750R（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；GM200刀式混合研磨儀（德國Retsch公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

谷物樣品經粉碎后，準確稱取5.000 g置于50 mL離心管中，加入10 mL水浸泡30 min后，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩2 min；加入1 g氯化鈉，4 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩2 min，以10 000 r/min離心6 min；吸取上清液于15 mL具塞離心管中，加入50 mg PSA、150 mg C18、900 mg無水硫酸鈉，渦旋2 min，以10 000 r/min離心6 min；取上清液于40 ℃水浴中氮吹至近干，用1 mL乙腈溶液復溶，經0.22 μm濾膜過濾后上機分析。

1.3.2 標準溶液配制

準確稱取10 mg噻霉酮標準品，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL標準儲備液，于-18 ℃冰箱保存。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱Waters BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈，流速0.25 mL/min；進樣量10.0 μL；柱溫40 ℃。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% B；0.5～2.5 min，10%～40% B；2.5～4 min，40%～90% B；4～4.1 min，90%～10% B；4.1～6 min，10% B。

1.3.4 質譜條件

離子源采用電噴霧正離子模式（electron spray ionization，ESI+*）；多重反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓3 200 V；離子源溫度300 ℃；脫溶劑溫度250 ℃。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

采用注射泵將1.0 μg/mL噻霉酮標準溶液注入離子源。在Q1 Mass模式下進行全掃描，分別考察在正離子（ESI+*）和負離子（ESI-*）2種模式下，噻霉酮各碎片離子的響應值。結果表明，噻霉酮在ESI+*模式下[M+H]+*的響應值較高，因此選擇正離子掃描模式。進一步優化碎裂電壓和碰撞能量等參數，使其達到最佳的離子化效率，確定的噻霉酮的質譜參數見表1。

表1 噻霉酮質譜參數

2.2 色譜柱的選擇

在相同色譜條件下，考察Waters HSS T3C18、Waters BEH C18、Shim-pack GIST C18、Thermo Hypersil GOLD C18對噻霉酮的分離度。結果發現，采用Waters BEH C18色譜柱對噻霉酮的分離效果最佳，靈敏度較好，而且在6 min內就可以完成對樣品的分析，分析速度顯著提高，見圖1。因此選擇Waters BEH C18柱作為分析柱。

圖1 噻霉酮的提取離子總離子流圖

2.3 流動相的選擇

分別以甲醇、乙腈作為有機相，0.1%甲酸水、0.1%甲酸水（含5 mmol/mL乙酸銨）、純水作為水相，進行組合條件的考察。結果發現：水相采用0.1%甲酸水比純水、0.1%甲酸水（含5 mmol/mL乙酸銨）可有效提高噻霉酮的離子化效率，增強響應信號，且有較好的峰形；以乙腈作為有機相時，與甲醇相比，可在短時間內將目標物分離出來，且出峰狀況更佳。以乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時，噻霉酮的分離效果、質譜信號響應強度最佳（圖1），因此選擇乙腈-0.1%甲酸水作為流動相。

2.4 提取溶劑的選擇

比較丙酮、乙腈、酸化乙腈（含5%甲酸）、乙酸乙酯對噻霉酮的提取效果。結果發現，乙腈對噻霉酮的提取效果最好。乙腈具有良好的沉淀蛋白質的作用，提取回收率最高。谷物中含有大量的淀粉、脂肪與蛋白質。加入PSA和C18吸附劑主要去除糖類、脂肪酸等，用無水硫酸鈉除水和鹽析提取液中的蛋白質，采用QuEChERS凈化方法可有效提高凈化效率，減少雜質對目標物的干擾。酸化乙腈提取時基質雜質干擾大，提取效率不高。用乙酸乙酯、丙酮提取谷物時凈化效果不理想，提取回收率均低于70%，且基質效應相對較大。因此，選擇乙腈作為提取溶劑。

2.5 基質效應

分別以乙腈和大米、小米、糙米、蕎麥、燕麥、小麥、紅米空白樣品提取液（空白樣品按照1.3.1處理所得）作為溶劑配制噻霉酮的溶劑標準溶液和基質標準溶液，比較兩者的平均響應值，用以判斷基質效應（matrix effect，ME）的影響。按式（1）計算[15]*。從表2可以看出，不同樣品基質的ME在76.3%～85.1%，不能忽略。因此，采用基質標樣外標法定量以確保結果的準確性。

2.6 線性范圍、檢出限和定量限

將質量濃度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0和50.0 ng/mL的標準工作溶液，按上述分析條件進行測定，外標法定量。以濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），制作標準曲線。

從表2可以看出，噻霉酮在0.1～50.0 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數（R2*）均大于0.999。對不同基質空白提取液進行加標測定，確定噻霉酮在大米、小米、糙米、蕎麥、燕麥、小麥和紅米中的方法檢出限均為0.03 μg/kg，定量限均為0.10 μg/kg。

表2 噻霉酮的基質效應、線性范圍、檢出限與定量限

2.7 準確度和精密度

在空白谷物樣品中分別添加0.1，10.0和50.0 μg/kg這3個濃度水平，按1.3.1對樣品進行前處理，每個濃度水平做6次平行試驗。從表3可以看出，平均加標回收率是84.8%～94.2%，相對標準偏差SRSD是1.5%～ 3.4%，表明方法的重現性與準確性均滿足分析要求。

表3 不同基質中噻霉酮的回收率和精密度（n=6）

2.8 實際樣品分析

應用試驗方法對70份市售的大米、小米、糙米、蕎麥、燕麥、小麥和紅米進行噻霉酮殘留檢測。結果顯示，在1份小麥中檢出有殘留，含量為0.15 μg/kg，其余樣品均未檢出。由于噻霉酮作為一種較好的殺菌劑被使用于谷物種植中，因此在日后檢測中應加強對谷物中該物質的風險監測，以保證膳食安全。

3 結論

試驗建立一種采用QuEChERS技術，運用液相色譜-串聯質譜法測定谷物中噻霉酮殘留的方法。該方法具有簡便、快速、靈敏度高的優點，適用于谷物中噻霉酮殘留的快速測定，滿足谷物中農藥殘留分析要求，為谷物的日常監管工作提供參考。