慢性乙型肝炎相關慢加急性肝衰竭前期免疫細胞的表達及意義

王 芳， 盧建華， 劉勇鋼， 張新羽， 閆會敏

1 河北醫科大學 公共衛生學院流行病學教研室， 石家莊 050017； 2 石家莊市第五醫院 臨床醫學研究所， 石家莊 050021； 3 天津市第二人民醫院 病理科， 天津 300192

慢性乙型肝炎(CHB)相關的慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF)是在慢性HBV感染引起的CHB基礎上出現的急性嚴重肝功能障礙臨床綜合征，病死率極高。因我國慢性HBV的高感染率，ACHBLF已成為影響患者生存質量的重要因素[1]。在CHB向ACHBLF進展過程中，存在著患者肝功能急劇惡化，但尚未達到肝衰竭的“肝衰竭前期(pre-ACHBLF)”階段[2]，如能在此階段進行預警及干預，則有可能預防進一步發展為肝衰竭。

目前普遍認為細胞免疫功能紊亂是ACHBLF發生的病理機制之一，許多免疫細胞如髓系抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSC)、調節性T淋巴細胞(Treg)、分泌IL-17的CD4 T淋巴細胞(IL-17-producing CD4 T cells，Th17)和細胞毒性T淋巴細胞等在肝衰竭的發病中發揮重要作用[3-5]。盡管既往許多研究已證實肝衰竭發病與免疫密切相關，但pre-ACHBLF階段的免疫狀態及其與疾病進展的關系尚不清楚，因此本研究探討了MDSC、Th17、Treg和分泌IL-17的CD8 T淋巴細胞(IL-17-producing CD8 T cells, Tc17)在pre-ACHBLF和ACHBLF患者中的表達，以期為ACHBLF的早期治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年8月—2019年5月于石家莊市第五醫院住院患者45例，其中ACHBLF患者、pre-ACHBLF患者和CHB患者各15例，同時選取于本院健康體檢者15例作為健康對照組(HC組)。ACHBLF和pre-ACHBLF的臨床診斷均符合《肝衰竭診治指南(2018年版)》[6]；CHB的臨床診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[7]。排除標準為合并其他病毒性肝炎或由酒精、藥物等原因導致的肝臟疾?。桓伟┗蚱渌麗盒阅[瘤伴有肝臟轉移；患有自身免疫性疾病、HIV感染、妊娠或有嚴重的心、肺、腎臟、神經系統等疾病。

1.2 標本采集與儲存 采用EDTA-K2抗凝的真空采血管于清晨空腹采集外周靜脈血約3 mL，取100 μL用于流式細胞儀檢測外周血MDSC頻數，剩余全血分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)。所有標本均為新鮮抗凝血，且在采集后4 h內處理。

1.3 流式細胞儀檢測外周血免疫細胞的水平 MDSC細胞檢測：取100 μL全血加至流式管中，然后分別加入CD11b-APC、CD33-PE和HLA-DR-PE/Cy7流式抗體各2 μL，避光孵育15 min后，每管加入溶血素500 μL，室溫避光靜置15 min，離心洗滌，加入流式鞘液300 μL重懸細胞，流式細胞儀檢測MDSC細胞比例。

Treg細胞檢測：收集PBMC，加入CD4-FITC和CD25-APC抗體各2 μL，4 ℃避光孵育30 min。經固定破膜處理后，離心洗滌2次，重懸細胞，然后加入10 μL Foxp3-PE抗體，4 ℃避光孵育45 min，離心洗滌，加入流式鞘液200 μL重懸細胞，流式細胞儀檢測。

Th17、Tc17細胞檢測：收集PBMC，用佛波醇酯和離子霉素刺激，同時加入GolgiStop，4 h后收集細胞至流式管，加入CD4-FITC和CD8a-PerCP/Cy5.5抗體各2 μL，4 ℃避光孵育30 min。經固定破膜處理后，離心洗滌2次，然后加入10 μL IL-17-APC抗體，避光孵育30 min，離心洗滌，加入流式鞘液200 μL重懸細胞，流式細胞儀檢測。

1.4 臨床檢驗指標的測定 肝功能檢測采用美國雅培公司C8000型生化分析儀，HBeAg檢測采用瑞士羅氏公司全自動Cobase601型電化學發光免疫分析儀，血常規檢測采用日本希森美康公司XN1000血液分析儀，并計算炎癥指標，包括中性粒細胞/淋巴細胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、單核細胞/淋巴細胞比值(monocyte-to-lymphocyte ratio, MLR)、血小板/淋巴細胞比值(platelet-to-lymphocyte ratio, PLR)與全身免疫炎癥指數(systemic immune inflammation index，SIRS)，SIRS=中性粒細胞×血小板/淋巴細胞。

2 結果

2.1 一般資料 四組間年齡與性別構成具有可比性，差異均無統計學意義(P值均>0.05)。ACHBLF組、pre-ACHBLF組和CHB組患者ALT與AST水平、HBeAg陽性比均明顯高于HC組(P值均<0.05)。ACHBLF組和pre-ACHBLF組患者TBil水平均明顯高于HC組(P值均<0.05)。ACHBLF組和pre-ACHBLF組患者PTA水平均明顯低于CHB組(P值均<0.05)(表1)。

表1 四組研究對象一般特征比較

2.2 MDSC、Th17、Treg和Tc17細胞的表達 MDSC、Th17、Treg和Tc17細胞水平在四組間差異均有統計學意義(P值均<0.01)。與CHB組比較，ACHBLF和pre-ACHBLF組的Th17、Treg和Tc17細胞水平均明顯升高(P值均<0.05)，同時pre-ACHBLF患者的MDSC細胞水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 四組研究對象MDSC、Th17、Treg和Tc17表達水平

2.3 pre-ACHBLF患者中免疫細胞與炎癥指標的關系 相關性分析顯示，在pre-ACHBLF患者中，MDSC與白細胞數、中性粒細胞數及NLR、MLR、SIRS呈正相關(P值均<0.05)，而Treg細胞僅與白細胞數呈正相關(P=0.043)。相反，Th17/Treg值和Tc17細胞水平與淋巴細胞數呈負相關(P值均<0.05)(表2)。

表2 pre-ACHBLF患者免疫細胞水平與炎癥指標的關系

3 討論

ACHBLF的發生發展涉及固有免疫和獲得性免疫的多個環節，已有許多研究[8]證實免疫細胞如樹突狀細胞、巨噬細胞、MDSC、T淋巴細胞等與ACHBLF的進展及預后密切相關，但尚未有研究評價這些細胞在pre-ACHBLF中的變化。本研究發現pre-ACHBLF患者中MDSC、Th17、Treg和Tc17均比CHB患者明顯升高，提示ACHBLF前期已存在嚴重的細胞免疫功能紊亂。因此，關注患者的病期變化，對pre-ACHBLF患者及早進行干預，維持細胞免疫平衡，可能對防止疾病進展起到重要作用。

MDSC是機體重要的免疫抑制細胞，具有抑制固有免疫和適應性免疫應答的作用，參與多種炎癥和免疫性疾病的發生發展。近年來，一些研究[9]相繼分析了MDSC在ACHBLF中的作用，發現ACHBLF患者MDSC頻數明顯升高，且隨患者病期程度加重，本研究也證實了以上結果。為了探討MDSC在ACHBLF疾病進程中的變化，本研究還觀察了pre-ACHBLF患者中MDSC的頻數，結果發現 pre-ACHBLF患者中MDSC頻數明顯高于CHB患者，且高于ACHBLF患者。推測隨著各種誘因導致CHB患者病情加重，肝細胞壞死及炎癥反應產生的多種因子誘導機體MDSC快速升高，以抑制過強的免疫反應；而在ACHBLF發生時，機體以免疫炎癥反應占主導，使MDSC頻數相應降低。目前國內外關于MDSC在CHB-pre-ACHBLF-ACHBLF進程中如何發揮作用的研究還很少，尚需要進一步深入探討。

值得注意的是，筆者團隊觀察到MDSC和Treg細胞的變化過程存在差異，MDSC水平在pre-ACHBLF患者中最高，而Treg細胞在ACHBLF患者中更高，此結果提示MDSC的增殖具有相對前置性，這兩類重要的抑制性細胞在ACHBLF進展的不同時期分別發揮作用。此外還發現pre-ACHBLF患者中MDSC水平與炎癥指標之間存在正相關性，而Treg水平僅與白細胞數呈正相關。目前炎癥和免疫反應是ACHBLF發生發展過程中的重要病理生理機制，隨著系統性炎癥反應綜合征的發生，炎癥介質的持續釋放導致ACHBLF患者出現血管內皮障礙，毛細血管滲漏和組織灌注不足而引起微循環紊亂,繼而引發器官衰竭。既往研究表明循環炎癥介質及肝細胞壞死釋放的損傷相關模式分子等可促進MDSC的增殖和分化[10]，而MDSC具有誘導Treg細胞擴增和分化的作用[11-12]。因此，這些研究提示在肝衰竭前期，過強的炎癥反應激活MDSC使其表達升高，形成以MDSC為主的免疫抑制狀態；隨著疾病進展，MDSC誘導Treg細胞表達，轉變為以Treg細胞為主的狀態。

Th17和Tc17是以分泌IL-17為主要特征的T淋巴細胞亞群，他們有著共同的分化刺激因子及分化調節通路，共同在炎癥性疾病、病毒感染、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病中發揮作用[13]。但是，這兩類細胞在許多方面如分子和代謝調節網絡、可塑性、表達變化也存在差異[14]。一項肝癌相關的研究[15]顯示，肝癌組織中分泌IL-17的細胞主要是Tc17細胞，而外周血中則主要是Th17細胞。在ACHBLF病理損傷過程中，已有大量研究證實ACHBLF患者的Th17細胞明顯升高，且與預后密切相關[16]，但僅有極少數研究報道了Tc17細胞在ACHBLF發生發展中的作用[17-18],特別是罕有研究觀察Tc17細胞在pre-ACHBLF患者的表達。本研究發現pre-ACHBLF和ACHBLF患者外周血Th17與Tc17細胞頻數顯著高于CHB患者，且Tc17的變化更明顯，推測Th17與Tc17細胞可能協同參與ACHBLF的疾病進程。

綜上所述，本研究發現pre-ACHBLF患者外周血MDSC、Treg、Th17細胞和Tc17細胞水平均明顯升高，特別是MDSC表達與炎癥指標呈密切相關性。盡管本研究病例數偏少，但研究結果對理解ACHBLF的疾病進展具有重要意義。將來進一步擴大樣本量進行驗證，并深入探討這些免疫細胞的作用機制，將為ACHBLF早期抗免疫治療提供更多的理論依據。

倫理學聲明：本研究方案于2019年4月30日經由石家莊市第五醫院倫理委員會審批，批號：2019009。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：王芳負責資料分析，撰寫論文；盧建華、劉勇鋼和張新羽參與課題設計，收集數據；閆會敏負責擬定寫作思路，指導撰寫文章，修改論文并最后定稿。